EVI1基因?qū)υ煅D(zhuǎn)錄因子的調(diào)控及ATO對其作用初探.pdf

1、目的：急性白血病是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的高異質(zhì)性及高死亡率的惡性克隆性疾病。根據(jù)現(xiàn)有的臨床研究資料顯示，約8％的AML患者存在EVI1基因的高表達(dá)，并且預(yù)示著不良預(yù)后且治療過程中對化療藥物不敏感。EVI1基因所處的3q26易產(chǎn)生染色體的斷裂，并形成 t(3;21)(q26;q22)Runx1-EVI1（AML1-EVI1）融合基因，通過多種途徑引起下游造血的改變進(jìn)而誘導(dǎo)白血病的發(fā)生及發(fā)展。雖然多年來國內(nèi)外有許多學(xué)者致力于研究EVI1單基

2、因的作用，但它對造血的影響還知之甚少，并且EVI1基因、AML1基因與AML1-EVI1融合基因的作用關(guān)系與差異更鮮有研究。因此本研究在體外利用白血病人細(xì)胞株探究EVI1對造血調(diào)控因子的影響，在體內(nèi)建立轉(zhuǎn)基因EVI1與轉(zhuǎn)基因AML1斑馬魚品系，研究上述基因?qū)υ煅恼{(diào)控，并探討白血病治療藥物三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）在體內(nèi)外對造血因子調(diào)控的影響。最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)，探討了臨床上常用的化療藥物阿霉素（Doxor

3、ubicin，DOX）的心臟毒性與其保護(hù)劑右丙亞胺（Dexrazoxane，DZR）的作用與機(jī)制，為臨床上個(gè)體化合理治療白血病提供了理論依據(jù)及新的思路。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)選取EVI1基因高表達(dá)的急性髓系白血病細(xì)胞株THP-1，利用健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞作為對照，通過逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RFQ-PCR）檢測EVI1基因及造血轉(zhuǎn)錄因子GATA1、GATA2、RUNX1、MPO、LMO2、C-MYB、PU.1與SCL

4、的mRNA相對表達(dá)量。之后分別以1μM、3μM、5μM的ATO溶液處理THP-1細(xì)胞株，并再次利用RFQ-PCR檢測EVI1基因及造血轉(zhuǎn)錄因子的mRNA相對表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用人源 AML1-EVI1融合基因中的AML1基因及 EVI1基因構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的質(zhì)粒Tol2-AML1與Tol2-EVI1，分別顯微注射至單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中，篩選成功表達(dá)目的基因的F0代（Founder）并將其培養(yǎng)至性成熟，并與AB系野生型斑馬魚（

5、WT）交配產(chǎn)卵后產(chǎn)生F1子代（分別為Tol2-EVI1-EGFP：TE；Tol2-AML1-EGFP：TA）。經(jīng)鑒定成功表達(dá)相應(yīng)目的基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中與野生型斑馬魚對照，在斑馬魚發(fā)育至1dpf、3dpf與7dpf時(shí)檢測上述造血轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在斑馬魚胚胎發(fā)育至18hpf時(shí)分別加50μM與100μM的ATO溶液，在同樣斑馬魚發(fā)育至1dpf、3dpf與7dpf時(shí)檢測相同造血轉(zhuǎn)錄因子與EVI1基因的表達(dá)變化。最后，本研究選擇24hpf的

6、AB品系野生型斑馬魚胚胎，分別暴露于0,1.84μM,18.40μM，36.80μM，46.00μM，55.20μM，64.40μM，73.60μM，82.79μM，91.99μM阿霉素中,選擇心臟毒性表型明顯的阿霉素濃度64.40μM,聯(lián)用或不聯(lián)用右丙亞胺48h，右丙亞胺濃度分別為130.47μM，260.93μM。在斑馬魚胚胎發(fā)育至72hpf時(shí)顯微鏡觀察心血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變，記錄心率變化。并分別抽提斑馬魚胚胎RNA檢測心臟發(fā)育相關(guān)基

7、因及氧化、抗氧化相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)在體外利用高表達(dá)EVI1基因的細(xì)胞株THP-1與正常人單核細(xì)胞通過RFQ-PCR的方法證實(shí)EVI1基因在體外可上調(diào)GATA2與CMYB基因的表達(dá)，并下調(diào)GATA1、RUNX1、MPO、LMO2、PU.1與SCL基因的表達(dá)水平。并且，ATO對EVI1基因的下調(diào)作用有著濃度依賴性與時(shí)間依賴性，對于其他轉(zhuǎn)錄因子皆有下調(diào)作用。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了高表達(dá)人源EVI1與截短型AML1

8、基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系TE與TA，并培養(yǎng)到F1代。實(shí)驗(yàn)證實(shí)EVI1基因高表達(dá)的斑馬魚有很嚴(yán)重的表型，并且對上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平均有不同程度的影響。ATO處理的TE品系斑馬魚可以降低EVI1基因的表達(dá)，并減輕其對GATA2的上調(diào)。對于藥物心臟毒性部分的研究發(fā)現(xiàn)隨著阿霉素濃度的升高，斑馬魚出現(xiàn)了如胚胎發(fā)育畸形、心包水腫等改變且死亡率升高，聯(lián)用右丙亞胺組可有效挽救阿霉素對斑馬魚心臟的毒性作用并顯著提升胚胎生存率。聯(lián)用130.47μM、260

9、.93μM右丙亞胺分別將存活率由35%提升至90%、88.3%（p<0.001）。通過RT-PCR檢測心臟發(fā)育相關(guān)基因nkx2.5、cmlc2、amhc、vmhc，未發(fā)現(xiàn)顯著改變。對氧化抗氧化指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)66.40μM濃度阿霉素可致斑馬魚胚胎MDA水平顯著上升（p<0.001），SOD活性明顯下降（p<0.001），右丙亞胺可有效清除MDA并恢復(fù)SOD活性。
　　結(jié)論：通過體外與體內(nèi)的方法，選擇與構(gòu)建了EVI1基因高表達(dá)的模型，