毛竹Lhca基因的克隆和光照在轉(zhuǎn)錄水平對其表達的調(diào)控.pdf

1、本論文采用RT-PCR法，從毛竹中克隆了捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)；LhcaPe02(GenBank EU121593)；LhcaPe03(GenBank EU366147)；LhcaPe04(GenBank EU366146)的全長。運用生物信息學(xué)方法對其核苷酸序列、編碼的氨基酸序列進行分析以及蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。為了解析毛竹PSI四條基因的功能，對毛竹進行了不同光照強度的處理，根據(jù)

2、熒光參數(shù)的變化判斷脅迫程度采集葉片，進行熒光實時定量PCR，選用GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因，正常光照的葉片作為對照，采用最大二階導(dǎo)數(shù)(2-ΔΔCt)的方法進行Lhca基因的相對定量，此外對同一時期不同組織Lhca四條基因的表達進行相對定量。本論文QRT-PCR采用SYBR-GreenⅠ嵌合熒光與熔解曲線結(jié)合法檢測Lhca基因家族成員。本論文得出如下結(jié)論：
　　(1) LhcaPe01基因cDNA全長為1051 bp，序

3、列從第39 bp開始到第779 bp含有1個開放閱讀框和一個中止密碼子，編碼246個氨基酸。在5′端有38 bp的非編碼區(qū)，在3′端含有242 bp的非編碼區(qū)和Poly(A)30 bp。此外，通過DNASTAR軟件預(yù)測，LhcaPe01編碼的蛋白質(zhì)等電點和分子量分別為5.4000和22107.34Da。通過ExPASy網(wǎng)站對序列進行分析得出：核酸序列中與光合相關(guān)的信號區(qū)有2個4Fe-4S鐵還原氧化蛋白的信號區(qū)和2個2Fe-2S鐵還原氧化

4、蛋白的信號區(qū)。該基因編碼的氨基酸序列含有3個蛋白激酶C磷酸化位點；2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點；5個N－肉豆蔻酰位點；2個葉綠素a/b結(jié)合蛋白位點。
　　(2) LhcaPe02基因cDNA全長為1100 bp，序列從第74bp開始到第862bp含有1個開放閱讀框和一個中止密碼子，編碼262個氨基酸。在5′端有73 bp的非編碼區(qū)，在3′端含有234 bp的非編碼區(qū)和Poly(A)14bp。LhcaPe02編碼的蛋白質(zhì)等電點和分子量

5、分別為6.14和28095.11 Da。該基因序列含有2個4Fe-4S鐵還原氧化蛋白的信號區(qū)，推導(dǎo)的氨基酸序列中含有氨基化合物位點為、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N－肉豆蔻酰位點和葉綠素a/b結(jié)合蛋白位點。
　　(3)LhcaPe03基因cDNA全長為1149 bp，序列從第76 bp開始到第861 bp含有1個開放閱讀框（open reading frame, ORF）和一個中止密碼子，編碼261個氨基酸。在5

6、′端有75 bp的非編碼區(qū)，在3′端含有288 bp的非編碼區(qū)和Poly(A)27 bp。LhcaPe03編碼的蛋白質(zhì)等電點和分子量分別為5.08和27686.79 Da。該基因核酸序列含有3個2Fe-2S鐵還原氧化蛋白的信號區(qū)和2個4Fe-4S鐵還原氧化蛋白的信號區(qū)，推導(dǎo)的氨基酸序列中含有氨基化合物位點、蛋白激酶 C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N－肉豆蔻酰位點和葉綠素a/b結(jié)合蛋白位點，還有一個yiaA/B two helix

7、 domain。
　　(4)LhcaPe04基因部分cDNA為1071 bp的基因，含有完整的編碼框，序列第1 bp開始到第738 bp含有1個開放閱讀框和一個中止密碼子，編碼245個氨基酸。5′端未克隆出非編碼區(qū)，在3′端含有304 bp的非編碼區(qū)和Poly(A)29 bp。LhcaPe04編碼的蛋白質(zhì)等電點和分子量分別為6.95和26898.83 Da。該基因核酸序列含有2個2Fe-2S鐵還原氧化蛋白的信號區(qū)，推導(dǎo)的氨基酸序列

8、中含有蛋白激酶C磷酸化位點、N－肉豆蔻酰位點、N－糖基化位點和葉綠素a/b結(jié)合蛋白位點。
　　(5)通過 NCBI Blast軟件分析得出與毛竹 Lhca基因同源性較高的物種是水稻和大麥。毛竹Lhca四條基因之間的核酸序列同源性高于推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性。四條基因編碼的四種蛋白分子二級結(jié)構(gòu)組成，LhcaPe01與其它三條基因差別較大，而LhcaPe02、LhcaPe03和LhcaPe04三者之間差別不明顯。根據(jù)SWISS MOD

9、EL預(yù)測和模擬，毛竹、大麥、水稻和玉米Lhca四條基因編碼的蛋白模型較相似，毛竹PSI四種蛋白之間的差異較大。
　　(6)剛竹屬三種竹種——紅殼竹、毛竹和角竹保守區(qū)內(nèi)核酸序列同源性非常高，Lhca1基因的同源性高達99％以上；Lhca2基因的同源性高達98％以上。總體而言，同屬竹種的同源性高于毛竹與禾本科的水稻和大麥；三個竹種Lhca1基因的同源性又相對高于Lhca2基因，說明剛竹屬內(nèi)竹種的Lhca1基因比Lhca2基因更保守。<

10、br>　　(7)PSΙ四條基因Lhca1～4在不同組織——新葉、老葉、莖尖、莖稈和筍中都有表達，但在不同組織中的表達水平存在差別。Lhca1基因在新葉中的表達量最高；Lhca2基因在老葉中的表達量最高；Lhca3基因和Lhca4基因在莖尖中的表達量最高。四條基因的表達量在不同組織中均以Lhca1基因最高；所有樣品中以Lhca3基因在筍中表達量最低；四條基因在莖尖中的表達量均較高。
　　(8)不同光照處理的葉片，PSΙ四條基因表達量

11、順序均為Lhca1>Lhca4>Lhca2>lhca3，強光下表達下調(diào)，弱光下表達上調(diào)，上調(diào)和下調(diào)的幅度不同。光強為3000μmol·m-2·s-1時，四條基因表達都出現(xiàn)下調(diào)，表達量分別是正常的89.5％，30.6％，48.3％，63.9％；下調(diào)幅度順序為Lhca2>Lhca3>Lhca4>Lhca1。光強為2000μmol·m-2·s-1時，表達量分別是正常的27.9％，17.8％，69.7％，35.1％；下調(diào)幅度順序為Lhca2>L

12、hca1>Lhca4>Lhca3。光強為1600μmol·m-2·s-1時，表達量分別是正常的73.3％，51.8％，35.7％，85.4％；下調(diào)幅度順序為Lhca3>Lhca2>Lhca1>Lhca4。
　　低光處理20天后葉片的相對表達量基本升高。光強為1000μmol·m-2·s-1時，四條基因表達都出現(xiàn)上調(diào)，表達量分別是正常的116.7％，115.4％，187.9％，102.4％；上調(diào)幅度順序為Lhca3>Lhca1>Lh

13、ca2>Lhca4。光強為500μmol·m-2·s-1時，Lhca1、 Lhca3、和Lhca4基因表達上調(diào)，Lhca2基因基本不變；表達量分別是正常的237.4％，99.1％，122.2％，147.5％；上調(diào)幅度順序為Lhca1>Lhca4>Lhca3>Lhca2。光強為10μmol·m-2·s-1時，表達量分別是正常的607.2％，168.5％，219.2％，149.6％；上調(diào)幅度順序為
　　Lhca1>Lhca3>Lhca