吉富羅非魚肝臟FAS、CAT基因的克隆及脂肪和膽堿、投飼率和投飼水平對其表達的影響.pdf

1、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是脂肪合成的關鍵酶，它催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，而后與甘油合成脂肪，對動物脂肪的沉積起重要作用。過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種廣泛存在于動植物體內(nèi)的氧化酶類，它主要用于分解體內(nèi)的H2O2，防止機體及生物大分子的氧化損傷。本研究以吉富羅非魚為研究對象，利用RT-PCR的方法克隆了肝臟FAS和CAT基因的cDNA全長，通過qRT-PCR方法分析了不

2、同飼料脂肪水平和膽堿水平、不同投飼頻率和投飼水平下，肝臟FAS和CAT基因的相對表達水平，主要研究結果如下:
　　1.本實驗克隆得到了FAS、CAT基因cDNA全長，片段大小分別為8779bp和3063 bp，分別編碼2511和527個氨基酸殘基。序列比較結果顯示，吉富羅非魚與其他已知物種FAS、CAT基因氨基酸的相似性都比較高，分別為61％～78％和67％～92％;此外吉富羅非魚推測氨基酸序列中存在與其他物種高度保守的特征序列，

3、FAS包含酮脂酰合酶的活性位點C161、軟脂酸硫解酶活性肽段“-SFGACVAF-”和烯酰還原酶的活性區(qū)域“-VFTTVGSMEKR-”，CAT包含血紅素結合位點“-RLFSYPDTH-”和酶活性位點序列“-FDRERIPERVVHAKGAG-”，三個參與催化的氨基酸殘基(His75、Asn148、Tyr358)，還有12個NADPH結合位點和C-末端的過氧化物酶體定位信號“SKM”。系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果表明分子生物學分類與傳統(tǒng)分類結果相

4、一致。生物信息分析顯示，F(xiàn)AS、CAT蛋白均不含信號肽和跨膜結構域，亞細胞定位于細胞質(zhì)中，推測它們?yōu)榉欠置谛偷鞍?。結構域預測顯示，F(xiàn)AS推測蛋白含有β-酮脂酰合成酶的N端、C端結構域(ketoacyl-synt)和(Ketoacyl-synt_C)、酰基轉移酶結構域(Acyl_transf_1)、脫水酶結構域(PS-DH)、烯基還原酶結構域(PKS_ER)，還含有酮基還原酶結構域(PKS_KR)、磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(PP-bind

5、ing)和硫酯酶結構域(Thioesterase)。CAT推測蛋白含有血紅素-過氧化氫酶核心結構域(Catalase domain)和過氧化氫酶相關的免疫應答序列(Catalase-rel)。通過蛋白二級結構分析顯示FAS、CAT二級結構都由α螺旋(Alpha helix)、延伸帶（Extended strand）、無規(guī)則卷曲(Random coil)組成，兩個蛋白三者的比例分別為35.84％、18.36％、45.80％和29.41％、

6、19.17％、51.42％。結論:克隆得到了吉富羅非魚FAS、CAT基因全長編碼片段，生物信息分析顯示FAS和CAT基因在不同物種中氨基酸序列和結構域都具有較高保守性，所編碼蛋白都為細胞質(zhì)蛋白。
　　2.為深入研究不同飼料脂肪和膽堿水平對吉富羅非魚幼魚肝臟FAS、CAT表達的影響，本試驗采用qRT-PCR技術分別檢測九組投喂不同脂肪水平和膽堿水平吉富羅非魚肝臟中FAS、CAT基因mRNA的相對表達量，實驗分組中飼料脂肪和膽堿水平分

7、別為組1:4％和500 mg· Kg-1、組2:4％和750 mg·Kg-1、組3:4％和1000 mg· Kg-1、組4:8％和500 mg·Kg-1、組5:8％和750 mg· Kg-1、組6:8％和1000 mg· Kg-1、組7:12％和500 mg· Kg-1、組8:12％和750 mg· Kg-1、組9:12％和1000 mg· Kg-1;每組3重復，每重復50尾，養(yǎng)殖63天。結果顯示:膽堿水平為500 mg· Kg-1時，

8、肝臟FAS的相對表達量隨脂肪水平的升高而逐漸降低，膽堿水平為750 mg·Kg-1時，隨著脂肪水平的升高，F(xiàn)AS的表達量顯著升高(P＜0.05)，當膽堿為較高水平(1000 mg·Kg-1)時，F(xiàn)AS表達量在脂肪水平為8％時達到峰值;當膽堿水平為750 mg·Kg和1000 mg· Kg-1時，肝臟CAT的相對表達量都隨脂肪的增加而先升高后降低，脂肪為8％組顯著高于4％組和12％組(P＜0.05)，而在膽堿水平較低(500 mg·Kg-

9、1)時，CAT的表達量則隨脂肪含量的升高而顯著上升(P＜0.05)。結果說明，膽堿較低時飼料脂肪水平的增加會抑制FAS的表達，適量的膽堿添加可以消除這種抑制，然而過量的膽堿同樣也會在高脂肪組對FAS的表達出現(xiàn)抑制作用;適當提高飼料脂肪水平會提高吉富羅非魚的抗氧化能力，而過量的脂肪反而會抑制其抗氧化能力，但膽堿水平較低時（500 mg· kg-1）高脂肪組會激活CAT的大量表達。
　　3.為深入研究投喂頻率和投喂水平對吉富羅非魚肝臟

10、FAS、CAT基因表達的影響，本試驗采用qRT-PCR技術分別檢測不同投喂頻率和不同投喂水平的吉富羅非魚肝臟中FAS、CAT基因mRNA的相對表達量，實驗組投喂次數(shù)和水平分別為:2次·d-1和2％、2次·d-1和4％、2次·d-1和6％、2次·d-1和8％、2次·d-1和10％、3次·d-1和2％、3次·d-1和4％、3次·d-1和6％、3次·d-1和8％、3次·d-1和10％，每個組合設3個重復，每重復60尾，養(yǎng)殖70天。結果顯示:投

11、飼頻率為每日2次時，隨著投喂水平的升高，吉富羅非魚肝臟中FAS基因的相對表達量先升后降，在投喂水平為10％時又再升高，其中4％、6％、8％組間差異不顯著(P＞0.05)，但6％組顯著高于2％組(P＜0.05)，且顯著低于10％組(P＜0.05);每日投喂3次時，除2％組，其他各組FAS表達量隨投喂水平的升高而先升后降再升高的趨勢更明顯，其中6％組顯著高于4％、8％組(P＜0.05)，顯著低于10％組(P＜0.05);當每日投喂2次時，肝