吉富羅非魚硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)基因的克隆及溫度與飼料脂肪源對(duì)其表達(dá)的研究.pdf

1、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturates，SCD)是合成單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)的限速酶，是調(diào)節(jié)肝臟脂肪生成和脂類氧化的關(guān)鍵控制點(diǎn)。經(jīng)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2014年全球100多個(gè)羅非魚養(yǎng)殖地區(qū)的年產(chǎn)量總和達(dá)5446800t，其中中國羅非魚產(chǎn)量在2014年增長至I450000t。由于羅非魚對(duì)低溫環(huán)境耐受力較差以及養(yǎng)殖過程中的不當(dāng)投喂，使

2、羅非魚產(chǎn)業(yè)受到重大的經(jīng)濟(jì)損失。吉富羅非魚是我國南方各省主要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，研究吉富羅非魚的SCD基因?qū)τ谔岣呖沟蜏啬芰疤岣呱唐肤~的營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)是國內(nèi)首次從吉富羅非魚體內(nèi)克隆得到SCD基因的cDNA序列，同時(shí)對(duì)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)時(shí)序特征進(jìn)行分析。并結(jié)合飼料中的脂肪酸組成和水溫對(duì)吉富羅非魚生長、生理、脂肪酸組成與SCD表達(dá)的影響，從營養(yǎng)、環(huán)境及分子水平較為深入研究了SCD的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為羅非魚的脂肪酸調(diào)控以及培育高品質(zhì)、

3、高營養(yǎng)價(jià)值的羅非魚提供了一定的理論依據(jù)。
　　1.吉富羅非魚SCD基因的克隆與序列分析
　　本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)克隆獲得了吉富羅非魚的SCD基因的cDNA全長序列。結(jié)果顯示，SCD基因的cDNA總長為1333bp，由173bp5'非編碼區(qū)、152bp3'非編碼區(qū)以及編碼

4、335個(gè)氨基酸的1008bp開放閱讀框組成。與GenBank中，尼羅羅非魚、莫桑比克羅非魚相似度較高，基因序列同源性分別達(dá)99％和98％，氨基酸序列同源性分別為99％和97％;與其他魚類SCD基因序列相似度達(dá)83％以上，氨基酸序列同源性達(dá)79％以上。與其他魚類的SCD基因相似度很高，說明該基因在物種間高度保守。
　　2.吉富羅非魚SCD基因組織及時(shí)空表達(dá)規(guī)律
　　本研究通過RT-PCR檢測(cè)了SCD基因在吉富羅非魚受精卵及胚胎

5、發(fā)育階段(受精后1h、12h、24h、48h、72h、96h)、仔稚魚階段(出膜后1d、5d、10d、15d、20d、25d、30d)及成魚組織（血、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、前腸、后腸、性腺、腦、皮膚、肌肉、鰓）中的表達(dá)。在胚胎發(fā)育的早期階段1h和12h時(shí)，SCD基因的表達(dá)量較高，24h時(shí)出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，48h時(shí)有所升高，隨后逐漸下降，96h最低。在受精卵及胚胎的早期階段(1-15d)時(shí)，SCD表達(dá)量較低，并呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)。20

6、d時(shí)SCD的表達(dá)量顯著升高，隨后呈先下降后升高的趨勢(shì)。表明了羅非魚在發(fā)育各個(gè)階段所需的脂肪酸營養(yǎng)不同，從而導(dǎo)致脂肪酸代謝酶的表達(dá)水平也有所不同，為吉富羅非魚繁殖階段及魚苗培育階段的脂肪酸營養(yǎng)的提供了理論依據(jù)。分別對(duì)雄魚和雌魚組織的SCD表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該基因在吉富羅非魚雄性和雌性的各組織表達(dá)量的高低有所不同，在肝臟中表達(dá)量均達(dá)到最高，其次在雄魚的精巢中表達(dá)量較高，而雌魚的肌肉中的表達(dá)量?jī)H次于肝臟。在雌魚和雄魚的脾臟中表達(dá)量均為最

7、低。證明了吉富羅非魚雌魚與雄魚的脂肪酸代謝機(jī)制具有一定差異，為進(jìn)一步研究羅非魚UFA的合成途徑及調(diào)控機(jī)理提供了一定理論基礎(chǔ)。
　　3.溫度對(duì)吉富羅非魚SCD基因表達(dá)的研究
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)吉富羅非魚在22℃、28℃和34℃三種不同養(yǎng)殖溫度下對(duì)SCD基因及肌肉脂肪酸相關(guān)性進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)生長指標(biāo)、血常規(guī)及血液生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。28℃終體重顯著高于22和34℃(P＜0.05)，F(xiàn)CR和PER均高于22和34℃。不同組間的肌肉脂肪酸

8、組成具有顯著性差異(P＜0.05)，SFA含量隨溫度的升高而降低而UFA含量呈相反的變化趨勢(shì)。22℃時(shí)羅非魚含較高的PUFA，尤其是n-3PUFA。SCD基因的表達(dá)及活性在低溫時(shí)顯著性升高(P＜0.05)，并且增加吉富羅非魚SCD的表達(dá)及活性可提升肌肉MUFA的合成。此外，降低水溫可降低機(jī)體TC和TG的含量，對(duì)于提高吉富羅非魚抗低溫能力具有一定幫助。
　　4.脂肪源對(duì)吉富羅非魚SCD基因表達(dá)的研究
　　日糧中添加不同脂肪源對(duì)

9、魚類的生長、生理等均具有一定影響，主要是由于飼料中脂肪酸組成不同，及不同魚類對(duì)脂肪酸利用不同引起的。本研究分別以椰子油(主要含SFA)、橄欖油（主要含MUFA）、魚油（脂肪酸比例均衡）及魚油+豆油(1∶1)(主要含PUFA)為脂肪源，進(jìn)行60d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。通過分析生長指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)飼料中添加脂肪酸比例較均衡的魚油組生長效果最好。添加不同脂肪源對(duì)血液和肝臟的生理指標(biāo)具有一定影響，添加SFA會(huì)引起血液與肝臟中TC、TG含量上升，而添加PUFA可

10、以有效地降低體脂的沉積。并且添加PUFA可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高抗氧化酶活性，降低氧化損傷。此外，飼料中不同脂肪酸組成對(duì)肌肉和肝臟脂肪酸的組成具有顯著性影響，魚體脂肪酸組成中的SFA及UFA分別于飼料脂肪酸組成的SFA及UFA呈正相關(guān)。并且飼料中高水平的PUFA會(huì)抑制SCD的表達(dá)與活性并降低體脂沉積而增加SFA會(huì)促進(jìn)SCD的表達(dá)與活性。因此，均衡日糧中的脂肪酸組成，適當(dāng)提高多不飽和脂肪酸含量有助于增加吉富羅非魚生長性能，降低血清脂肪沉積