奶山羊硬脂酰輔酶A去飽和酶單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)既是乳中調控不飽和脂肪酸合成的限速酶，同時又是反芻動物肉及乳中共軛亞油酸內(nèi)源合成的關鍵酶，能催化飽和脂肪酸發(fā)生去飽和反應，對羊奶脂質組成及代謝具有重要的調控作用，山羊特異性SCD抗體對該基因的脂肪酸調控功能研究等十分必要。
　　本研究旨在用原核表達純化后的SCD重組蛋白免疫小鼠，制備針對奶山羊(Capra hircus)SCD的單克隆抗體并進行鑒定，明確該抗體的特性為研究SCD的功能提供了有效的工具。

2、通過生物信息學分析選取SCD基因目標序列，采用PCR方法擴增SCD基因，連接至pET32a(+)原核表達載體上，重組質粒pET32a(+)-SCD在大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中誘導表達;使用組氨酸標簽蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，純化的SCD融合蛋白經(jīng)常規(guī)免疫法免疫4～6周齡的雌性Balb/c小鼠，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測得到的免疫血清效價;將脾細胞及SP2/0用促融劑融合制備雜交瘤克隆

3、，ELISA鑒定陽性克隆孔，并進行3次亞克隆;選用12周齡個體較大的小鼠注射鑒定結果為陽性的雜交瘤克隆誘生腹水，純化腹水中單抗，再對純化后得到的SCD單抗進行一系列生物學特性鑒定。本研究的主要結果如下:
　　1.PCR擴增獲得了SCD N端210bp序列，成功構建了pET32a(+)-SCD重組載體。重組質粒轉化至Rosetta(DE3)，IPTG誘導后，成功生產(chǎn)得到了His-SCD目標融合蛋白，大小為30kD。
　　2.重

4、組蛋白的最佳表達條件為:溫度25℃，IPTG1mmol/L，誘導表達時間12h。在此條件下，由Rosetta(DE3)上清中獲得了可溶的SCD重組蛋白，純度高，濃度為2.5mg/mL，滿足免疫需求。
　　3.用獲得的SCD重組蛋白當作抗原注射小鼠，用PEG誘導發(fā)生成功免疫應答的脾細胞與SP2/0進行細胞融合，利用ELISA方法篩選陽性雜交瘤克隆，經(jīng)過至少3次亞克隆得到了一株陽性雜交瘤細胞系。
　　4.小鼠接種陽性克隆細胞誘生