抗輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫-還原酶(NRDR)單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、全反式維甲酸(All-trans retinoic acid, atRA)是維生素A(Vitamin A)的代謝產(chǎn)物,是脊椎動物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì),通過與其核內(nèi)受體結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生、免疫功能調(diào)節(jié)等生理過程。在抗感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長及增殖、誘導(dǎo)(腫瘤)細(xì)胞分化和凋亡等方面,維甲酸類化合物也具有廣泛的生物學(xué)作用。臨床上,維甲酸類化合物已廣泛應(yīng)用于預(yù)防及治療一些惡性腫瘤,包括乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、早幼

2、粒細(xì)胞白血病等。體內(nèi)維甲酸類化合物的平衡受飲食及其相關(guān)代謝酶等因素的影響,其相關(guān)酶類調(diào)控代謝的機(jī)制至今仍未完全闡明。
　　輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶(NADP(H) dependent retinol dehydrogenase/reductase, NRDR)是從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種酶,具有很強(qiáng)的視黃醇氧化與視黃醛還原活性。視黃醇(Ratinol)在體內(nèi)經(jīng)兩步代謝生成維甲酸,中間代謝產(chǎn)物為視黃醛(Ratinal)。Rati

3、nol生成Ratinal的反應(yīng)是體內(nèi)維甲酸合成的限速步驟,因此NRDR在調(diào)節(jié)生物體內(nèi)維甲酸的穩(wěn)態(tài)過程中起著重要作用。
　　鑒于NRDR分子功能的多樣性及重要性,本課題以重組的兔NRDR蛋白為免疫原,免疫Balb/c小鼠,制備出高效價、高特異性的單克隆抗體(mAb),為NRDR的生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　我們以純化的重組兔NRDR蛋白為免疫原,采用皮下多點(diǎn)注射法免疫Balb/c小鼠。將成功免疫小鼠的脾臟制成脾細(xì)胞

4、懸液,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1進(jìn)行細(xì)胞融合,通過間接ELISA法篩選陽性細(xì)胞,采用傳統(tǒng)的有限稀釋法進(jìn)行亞克隆培養(yǎng),最終得到可穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞,并通過誘生腹水法制備獲得大量單克隆抗體。間接ELISA法檢測mAb的效價并比較幾株單抗的相對親和力大小,Ig亞類鑒定試劑盒鑒定mAb的Ig亞類, Western blot鑒定mAb的特異性。
　　最終,我們通過雜交瘤技術(shù)獲得3株可分泌特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞NR1、NR2和NR5,其