兔輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫-還原酶的表達(dá)、純化、活性鑒定及多克隆抗體制備.pdf

1、維甲酸類物質(zhì)是脊椎動物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì),通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄參與形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、免疫功能調(diào)節(jié)等生理過程;在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡以及抗感染等病理過程中也具有廣泛的生物學(xué)效用。細(xì)胞內(nèi)維甲酸類物質(zhì)的平衡受飲食、體內(nèi)相關(guān)代謝酶類等多因素的影響,但是相關(guān)酶類調(diào)控維甲酸類物質(zhì)代謝的機(jī)制到現(xiàn)在仍然沒有完全闡明。
　　輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶(NADP(H)-dependent retinol dehy

2、drogenase/reductase,NRDR)是黃東陽教授等于1997年從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種能催化視黃醇和視黃醛之間氧化脫氫過程的酶,體外實(shí)驗(yàn)顯示該酶對視黃醛有很高的底物特異性和親和性。視黃醇和視黃醛之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)是體內(nèi)維甲酸合成的限速步驟,因此NRDR對體內(nèi)維甲酸類物質(zhì)的平衡可能起著調(diào)節(jié)作用,其功能性表達(dá)將有助于對其進(jìn)行系統(tǒng)性研究。
　　本研究采用Gateway基因克隆和蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)對NRDR進(jìn)行

3、表達(dá)。首先從兔肝中克隆NRDR全長序列,將其編碼區(qū)構(gòu)建至pDESTTM17上,再轉(zhuǎn)化到BL21-AI工程菌中表達(dá)出兔NRDR蛋白并鑒定其表達(dá)形式;取工程菌裂解上清通過一步金屬離子親和層析純化得到該蛋白。取純化蛋白以反相高效液相色譜法(HPLC)測定該酶的Km和Vmax值。最后以純化蛋白免疫豚鼠,獲得豚鼠抗兔NRDR多克隆抗體,以Western-Blot法分析抗體特異性。
　　本研究最終獲得了可溶性的NRDR蛋白,而且具備較高的視黃

4、醛還原活性。經(jīng)過分析,確認(rèn)誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后目的蛋白的表達(dá)量最高,可占總蛋白量的41.4％;通過一步金屬離子親和層析可以得到純度為97.2%的兔NRDR,而比活性提高了64倍;進(jìn)一步對該酶進(jìn)行活性分析, HPLC測得該酶對視黃醛的Km值為(4.55±0.33)μmol,Vmax為(0.307±0.065)μmol/(min·mg),活性與兔肝中的純化蛋白相近。將獲得的多克隆抗體應(yīng)用于Western-Blot中檢測兔NRDR效果良好,為NR