吉富羅非魚HL、LPL基因克隆及飼料膽堿和脂肪水平、投飼頻率和投喂水平對其在肝臟中表達的影響.pdf

1、酯酶(Esterase)是一種水解酶，可在水分子的參與下，經(jīng)由水解作用，將甘油三酯、磷脂和膽固醇酯等酯類切割成酸類與醇類。此類酶參與多種生物化學(xué)反應(yīng)，依其專屬受質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及功能而有不同。催化水解各種酯鍵的一類酶。通常還包括催化水解羧酸酯和磷酸酯的二類酶。在催化羧酸酯的酯酶中，最常見的如脂肪酶，可催化水解甘油三酯為甘油和脂肪酸。酯酶的催化作用對食物中脂肪的吸收、平衡能量和血漿脂蛋白的代謝起著重要的作用。目前針對酯酶的研究發(fā)現(xiàn)，具上

2、述功能的酶包括脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase，LPL)、肝脂酶(Hepatic lipase，HL)、內(nèi)皮脂酶(Endothelial lipase，EL)和胰脂酶(Pancreatic lipase，PL)等。本研究以吉富羅非魚為研究對象，首次采用RT-PCR和RACE法從吉富羅非魚(farmed tilapia)肝臟克隆得到HL、LPL基因全序列。并通過qRT-PCR技術(shù)分析不同脂肪、膽堿以及投飼頻率、投喂水平下H

3、L和LPL在肝臟中表達的豐度。主要研究結(jié)果如下:
　　1.HL基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示吉富羅非魚HL基因包含全長編碼區(qū)片段大小為1872bp，其中5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為217bp，3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為176bp，開放閱讀框（ORF）為1479bp，編碼493個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為6.3104kD。PolyA加尾信號為AATAAA。
　　2.HL基因生物信息學(xué)分析。序列同源性及系統(tǒng)進化分析

4、表明，吉富羅非魚與羅非魚、大口黑鱸、鱖魚、真鯛、斜帶石斑魚、鰱魚HL基因序列同源性較高，分別為96.6％、84.68％、80.89％、79.48％、76.52％、75.89％;與人、大鼠、小鼠和中華鱘HL基因同源性較低，分別為48.7％、48.99％、49.41％、60.9％。吉富羅非魚與羅非魚、大口黑鱸HL氨基酸序列同源性最高，而與人、老鼠、中華鱘HL氨基酸序列同源性最低。這與其親緣遠近關(guān)系相符合，表明吉富羅非魚HL基因在進化中相對保

5、守;使用ExPASy在線軟件分析HL基因的氨基酸組成，結(jié)構(gòu)顯示，該HL由486個氨基酸組成，最高含量的氨基酸是亮氨酸(10.1％)，甘氨酸(7.6％)為第二多含量氨基酸，最低含量的氨基酸是色氨酸(1.9％)。功能分析發(fā)現(xiàn)，HL氨基酸理論等電點為8.72，分子量為6.3104kD，負電荷氨基酸殘基總數(shù)(AsP+Glu)為54個，正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為62個，不穩(wěn)定系數(shù)39.65，脂肪系數(shù)84.24，總水平疏水性-0.32

6、8。應(yīng)用SignIP程序?qū)L蛋白N—末端信號肽進行預(yù)測，結(jié)果顯示，吉富羅非魚HL含有30個氨基酸信號肽。功能結(jié)構(gòu)表明，吉富羅非魚和其他魚類HL基因氨基酸序列中均存在脂質(zhì)結(jié)合位點、N-糖基化位點、保守的半胱氨酸位點和催化位點。HL的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析顯示，無規(guī)則卷曲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為主，α-螺旋和延伸帶散布于整個蛋白中。
　　3.LPL基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示吉富羅非魚LPL基因包含全長編碼區(qū)片段大小為2300bp，

7、其中5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為126bp，3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為629bp，開放閱讀框（ORF）為1545bp，編碼515個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為5.813596kD。
　　4.LPL基因生物信息學(xué)分析。LPL基因的序列同源性及系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚LPL氨基酸序列與哺乳動物同源性為56.12％～56.54％，與雞同源性為57.35％，與真骨魚斑馬魚、鱖魚、大口黑鱸等同源性為67.51％～92.31％，表明LPL

8、在進化中相對保守。其中吉富羅非魚與鱖魚LPL氨基酸序列同源性最低，為67.51％，與大口黑鱸同源性最高，達到92.31％。通過相關(guān)軟件進行氨基酸序列對比，結(jié)果顯示本研究克隆的吉富羅非魚肝臟LPL氨基酸與其他物種相比，具有很強的保守性，從中可以證明，本研究克隆得到的正是吉富羅非魚的LPL基因。應(yīng)用MEGA3.1軟件N-J方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示真鯛、斜帶石斑魚先聚為一支再和吉富羅非魚聚為一支，而小鼠和大鼠聚為一支再和原雞聚為一支，從形態(tài)

9、學(xué)和生化特征分類來看，本研究得到系統(tǒng)進化樹符合相關(guān)的規(guī)律，進一步說明克隆的為吉富羅非魚LPL基因。使用相關(guān)軟件進行LPL氨基酸分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)由513個氨基酸組成，其中蘇氨酸含量最高為9.0％，其次是亮氨酸7.8％，半胱氨酸含量最低(1.9％)。功能分析發(fā)現(xiàn)，LPL氨基酸理論等電點為8.54，分子量為57.8538kDa，負電荷氨基酸殘基總數(shù)(AsP+Glu)為53個，正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為58個，不穩(wěn)定系數(shù)3

10、0.98，脂肪系數(shù)79.81，總水平疏水性-0.323。信號肽研究發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚LPL含有24個氨基酸信號肽的蛋白質(zhì)。功能結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚的LPL基因氨基酸序列中與其他魚類一樣都發(fā)現(xiàn)存在N-糖基化位點、保守的半胱氨酸位點、脂質(zhì)結(jié)合位點和催化位點。LPL的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析顯示，無規(guī)則卷曲蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為主，α-螺旋和延伸帶散布于整個蛋白中。
　　5.不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中HL活性的表達。應(yīng)用qR

11、T-PCR的方法檢測了吉富羅非魚肝臟中不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中肝脂酶活性的表達，結(jié)果顯示膽堿水平分別為750mg/kg和1000mg/kg時，吉富羅非魚肝臟HL基因表達量隨著脂肪水平（4％、8％和12％）的上升而增加，組間差異極顯著(P＜0.01)。當(dāng)脂肪水平為相同4％時，吉富羅非魚肝臟HL基因表達量隨著膽堿水平(500mg/kg、750mg/kg和1000mg/kg)的上升先下降后上升。而脂肪水平為8％和12

12、％時，肝臟HL基因表達量隨著膽堿水平一直處于上升的狀態(tài);不同投喂水平和投喂頻率對吉富羅非魚肝臟HL mRNA表達的影響的實驗表明，當(dāng)投喂頻率為2次/d時，吉富羅非魚肝臟HLmRNA表達量隨著脂肪水平(2％～10％)的上升先下降后上升，除了脂肪水平為4％的時候，其他脂肪水平的肝臟HL mRNA的表達量均比對照組（2次/d，脂肪水平2％）高。其中脂肪水平10％與2％、8％之間，脂肪水平4％與6％之間均差異顯著(P＜0.05)，4％與10％之

13、間差異極顯著(P＜0.01）;投喂頻率為3次/d時，各個脂肪水平肝臟HL mRNA表達量總體比對照組（2次/d，脂肪2％）高，且隨著脂肪含量的上升，肝臟HL mRNA表達量也呈現(xiàn)上升的趨勢。其中脂肪水平為2％與其他組之間，脂肪水平4％與8％、10％之間，脂肪水平6％與10％之間肝臟HL mRNA表達量差異極顯著（P＜0.01），脂肪水平8％與10％之間肝臟HLmRNA表達量差異顯著（P＜0.05），其他組之間差異不顯著(P＞0.05）。

14、
　　6.不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中LPL活性的表達。應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測了吉富羅非魚肝臟中不同膽堿水平、脂肪水平和投喂頻率、投喂水平下肝臟中肝脂酶活性的表達，結(jié)果顯示，膽堿水平為500mg/kg時，吉富羅非魚肝臟LPL基因表達量隨著脂肪水平（4％、8％和12％）的上升先下降后上升。膽堿水平為750mg/kg時，吉富羅非魚肝臟LPL基因表達量隨著脂肪水平（4％、8％和12％）的上升而下降，各組之間差

15、異極顯著(P＜0.01)。膽堿水平為1000mg/kg時，肝臟LPL基因表達量隨著脂肪水平(4％、8％和12％)的上升而呈現(xiàn)上升的趨勢，各組之間差異極顯著(P＜0.01）;分析脂肪不變，肝臟中LPL基因表達量的變化情況為，脂肪水平為4％時，肝臟中LPL基因表達量隨著膽堿水平的上升而先上升后下降，但脂肪水平為12％時，肝臟中LPL基因表達先下降再上升。脂肪水平為8％時，隨著膽堿水平的上升，肝臟中LPL基因表達也一直呈現(xiàn)上升的趨勢;投喂頻率

16、2次/d情況下，隨著飼料中脂肪水平增加，吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達量先下降再上升繼而下降又上升的多變趨勢，各組之間差異極顯著(P＜0.01）。當(dāng)投喂頻率3次/d，脂肪水平為2％和4％時，吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達量均低于對照組(2次/d、脂肪水平2％)，且隨著脂肪水平的上升而下降組間差異不顯著(P＞0.05）。但當(dāng)脂肪水平為6％至10％時，吉富羅非魚肝臟LPL mRNA表達量隨著脂肪水平的上升而呈現(xiàn)上升的趨勢，且表達量均