KLF4對(duì)小鼠成骨細(xì)胞成骨分化及基質(zhì)分泌的影響.pdf

1、目的：
　　牙周炎(periodontal disease)是威脅人類(lèi)口腔健康的常見(jiàn)病之一，是細(xì)菌及代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的作用于牙周支持組織的具有慢性破壞性的疾病。牙周炎主要臨床表現(xiàn)為牙槽骨的吸收破壞，病理學(xué)變化顯示為骨新生的不足—骨生成與骨吸收失衡所致。由于牙周炎患病率高，與全身的健康密切相關(guān)，目前其臨床治療方式主要為對(duì)癥處理，控制牙周炎的繼續(xù)發(fā)展，對(duì)牙周炎所造成的骨質(zhì)缺損尚無(wú)有效的治療措施，因此深入探索骨形成的機(jī)制對(duì)于牙周炎的防治具有

2、極其重要的作用。
　　骨平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，成骨細(xì)胞所引起的骨生成與破骨細(xì)胞所導(dǎo)致的骨吸收之間的平衡統(tǒng)一是維持骨代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。大量研究表明若骨形成少于骨吸收時(shí)，將導(dǎo)致如骨質(zhì)疏松、牙周病、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等骨疾病;反之則導(dǎo)致骨硬化疾病。其中，成骨細(xì)胞為骨代謝平衡的主導(dǎo)因素之一，其活性可以被多種因素調(diào)節(jié)。因此骨生成的分子機(jī)制的研究對(duì)提高骨疾病所導(dǎo)致缺損的修復(fù)治療效果具有臨床意義。
　　越來(lái)越多的研究都集中在成骨細(xì)胞的

3、發(fā)生、增殖、分化中，這表明了在骨相關(guān)疾病中成骨細(xì)胞對(duì)骨再生的重要性。基于以上分析，本研究擬通過(guò)成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)出實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，通過(guò)過(guò)表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子KLF4觀察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化相關(guān)基因的影響，從而探討KLF4對(duì)成骨細(xì)胞早期成骨分化的影響;最后本研究對(duì)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中KLF4對(duì)骨平衡所涉及的基質(zhì)分泌的影響，明確KLF4在成骨細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮的作用，為牙周疾病臨床診治進(jìn)一步提出理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用分

4、段酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得成骨原代細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)液分別培養(yǎng)9d和21d后采取ALP染色和茜素紅染色對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　2.采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞中KLF4的表達(dá);成功構(gòu)建攜帶KLF4的重組腺病毒載體(Ad-KLF4)，成骨細(xì)胞經(jīng)不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的Ad-KLF4轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。將成骨細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照

5、組（未轉(zhuǎn)染組）、KLF4組（Ad-KLF4轉(zhuǎn)染）和GFP組（Ad-GFP轉(zhuǎn)染），經(jīng)最佳MOI感染后MTT測(cè)定細(xì)胞增殖，Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、核心蛋白結(jié)合因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)的表達(dá)。
　　3.采用western-blot檢測(cè)成

6、骨細(xì)胞成骨分化過(guò)程KLF4，MMP2及COL1的表達(dá);siRNA KLF4或者Ad-KLF4處理成骨細(xì)胞后，在成骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞早期分化過(guò)程(0d、2d、4d)通過(guò)wester-blot及Real-timePCR觀察其對(duì)MMP2及COL1蛋白及基因表達(dá)的影響;
　　結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)利用酶消化法從新生小鼠顱骨片中獲得細(xì)胞形態(tài)呈多邊形、立方形的成骨原代細(xì)胞。ALP染色可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)大量沙礫狀藍(lán)染陽(yáng)性顆粒，茜素紅染色可見(jiàn)呈細(xì)胞

7、外成片紅色礦化團(tuán)塊。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察以及染色鑒定表明通過(guò)分段酶消化法可以分離培養(yǎng)出成骨原代細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步順利進(jìn)行打下基礎(chǔ)。
　　2.經(jīng)PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序成功構(gòu)建出攜帶KLF4基因的重組腺病毒載體(Ad-KLF4)。成骨細(xì)胞經(jīng)最適合MOI(100PFU/ml)處理后，KLF4組可觀察到KLF4蛋白及mRNA水平顯著上升;成骨細(xì)胞增殖速率明顯上升;成骨分化相關(guān)基因ALP、RUNX2、BSP的水平顯著下降。
　　3.

8、隨著成骨細(xì)胞成骨分化時(shí)間的延長(zhǎng)，KLF4的表達(dá)不斷上升，伴隨著MMP2表達(dá)下降及COL1表達(dá)的升高。經(jīng)40NM的KLF4siRNA感染后，KLF4基因及蛋白表達(dá)明顯下降，同時(shí)MMP2的表達(dá)上升，COL1的表達(dá)下降;經(jīng)MOI=100PFU/ml的Ad-KLF4感染后，KLF4表達(dá)水平顯著上升，相反MMP2表達(dá)下調(diào)，COL1的基因及蛋白水平依然呈下降趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)利用分段酶消化法成功獲得成骨原代細(xì)胞，且第二代