缺氧對多孔鉭-人成骨細胞復(fù)合物細胞增殖、分泌功能及成骨基因表達的影響.pdf

1、目的:本研究通過觀察缺氧對接種于多孔鉭支架材料上的成骨細胞形態(tài)學(xué)、增殖能力、分泌功能以及相關(guān)成骨細胞因子的影響，對比常氧和缺氧下成骨細胞功能的差異，證實缺氧對成骨細胞增殖、分泌功能的抑制作用，探討多孔鉭支架在模擬人體體內(nèi)缺氧微環(huán)境下的生物相容性及在修復(fù)骨缺損、骨再生的作用，為進一步體內(nèi)實驗及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.大體及掃描電鏡觀察多孔鉭支架形態(tài)特征。成骨細胞的培養(yǎng)和實驗分組：選用MG63成骨細胞進行分離

2、培養(yǎng)、傳代及鑒定。將生長狀態(tài)良好的第3代成骨細胞以1×106/L-1細胞濃度接種于多孔鉭支架復(fù)合培養(yǎng)。設(shè)2％氧濃度環(huán)境作為缺氧模型，20%氧濃度環(huán)境作為常氧模型。設(shè)缺氧組（缺氧下成骨細胞單純培養(yǎng)）和缺氧鉭組（缺氧下成骨細胞與多孔鉭共培養(yǎng)）作為實驗組，與常氧對照組（常氧下成骨細胞單純培養(yǎng)）作對比。
　　2.成骨細胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡觀察每日常氧及缺氧狀態(tài)下成骨細胞生長；掃描電鏡觀察成骨細胞與多孔鉭材料附著；透射電鏡觀察常氧和

3、缺氧下成骨細胞超微結(jié)構(gòu)改變；
　　3.CCK-8法檢測各組成骨細胞生長和增殖。
　　4.ELISA法檢測各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC分泌水平。
　　5.免疫細胞化學(xué)法檢測各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC表達。
　　6.實時熒光定量PCR法檢測各組多孔鉭材料對成骨細胞COL-Ⅰ、OC基因表達。
　　結(jié)果:
　　1.多孔鉭表面及斷面可見分布均勻的蜂窩狀孔隙，孔徑針尖大。掃描電鏡下材料表面及斷面分布均勻直徑約4

4、00～600μm的微孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)部孔隙相互連通。孔隙為三維立體的連通結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)類似于松質(zhì)骨構(gòu)架。
　　2.倒置相差顯微鏡顯示常氧下成骨細胞生長良好，細胞形態(tài)及大小均正常；短期缺氧細胞形態(tài)及數(shù)量未明顯改變，第4d細胞數(shù)量較常氧下略少，第7d細胞未鋪滿瓶底，部分細胞脫落；掃描電鏡顯示：成骨細胞在多孔鉭支架微孔內(nèi)黏附、生長并分泌細胞外基質(zhì)；透射電鏡下顯示：常氧下多孔鉭-成骨細胞復(fù)合物細胞胞質(zhì)內(nèi)大量細胞器，核仁較大，大量分泌小泡，染色質(zhì)豐

5、富。缺氧下多孔鉭-成骨細胞復(fù)合物細胞胞膜絨毛狀小突起增多，細胞核固縮，染色質(zhì)凝結(jié)，線粒體嵴腫脹。
　　3.CCK-8法檢測各組細胞增殖：缺氧下成骨細胞增殖能力較常氧下各組成骨細胞顯著降低（P＞0.05），常氧鉭組成骨細胞增殖能力高于常氧對照組；缺氧鉭組、缺氧組成骨細胞增殖能力較常氧對照組顯著減弱，隨缺氧程度加深多孔鉭-成骨細胞復(fù)合物細胞增殖能力逐漸減弱（P＜0.05）。
　　4.ELISA法檢測各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC分

6、泌水平：缺氧鉭組、缺氧組成骨細胞COL-Ⅰ、OC分泌水平較常氧組顯著降低（P＜0.05）；第7d缺氧鉭組COL-Ⅰ分泌水平較缺氧組升高。5d、7d缺氧鉭組成骨細胞OC分泌水平較缺氧組升高。
　　5.免疫細胞化學(xué)檢測各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC的表達情況：缺氧組、缺氧鉭組成骨細胞COL-Ⅰ、OC表達較常氧對照組顯著降低（P＜0.05）。
　　6.RT-QPCR檢測各組成骨細胞COL-Ⅰ和OC基因表達情況：缺氧組、缺氧鉭組成骨細

7、胞COL-Ⅰ、OC基因相對表達量較常氧對照組明顯降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.多孔鉭-成骨細胞復(fù)合物在不同缺氧條件下（3%PO2、2% PO2、1%PO2）伴隨時間的延長及缺氧程度的加重，缺氧均可使各組成骨細胞的增殖能力減弱，其中以2%PO2、1% PO2效果最顯著。
　　2.嚴(yán)重缺氧可導(dǎo)致鉭-成骨細胞復(fù)合物成骨細胞出現(xiàn)線粒體腫脹、線粒體嵴減少或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒等超微結(jié)構(gòu)病變。
　　3.缺氧可