原纖毛—多囊腎病蛋白復(fù)合物對成骨細(xì)胞功能及骨骼形成作用的研究.pdf

1、骨骼的發(fā)育從胚胎早期間充質(zhì)向骨原細(xì)胞分化開始，經(jīng)歷不斷地生長與改建，直到成年達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡。成年骨的穩(wěn)態(tài)主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的分解吸收兩個(gè)方面。只有這兩個(gè)方面達(dá)到平衡，才能維持正常的骨量和密度。骨的形成分成兩種形式:膜內(nèi)成骨和軟骨膜內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨是顱蓋骨的主要形成方式，這種方式是先由間充質(zhì)分化成為胚性結(jié)締組織膜，然后在此膜內(nèi)成骨。主要的過程為間充質(zhì)細(xì)胞聚集并分化成骨原細(xì)胞，骨原細(xì)胞進(jìn)而分化成成骨細(xì)胞;成骨細(xì)胞隨后

2、分泌類骨質(zhì)，并包埋在其中，成為骨細(xì)胞;類骨質(zhì)繼而鈣化成骨基質(zhì)，形成骨化中心。而軟骨內(nèi)成骨則主要是以軟骨細(xì)胞為基礎(chǔ)，當(dāng)間充質(zhì)細(xì)胞分化成骨原細(xì)胞以后，骨原細(xì)胞先分化成軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)將細(xì)胞包埋其中，形成軟骨雛形，繼而軟骨膜深層的的骨原細(xì)胞分裂并分化為成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞在軟骨表面產(chǎn)生類骨質(zhì)，自身也被包埋其中而成為骨細(xì)胞。因而軟骨內(nèi)成骨既包括與膜內(nèi)成骨相似的過程，又包括軟骨生長和退化，軟骨組織不斷被骨組織取代的特有發(fā)生過程。大多數(shù)

3、的骨骼，包括四肢和軀干，都是通過這種方式形成的。不管是膜內(nèi)成骨還是軟骨膜內(nèi)成骨，成骨細(xì)胞都受到系統(tǒng)和局部多種因素的調(diào)控，從而激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+，cAMP/PKA，Hedgehog，Wnt等多條信號(hào)通路。
　　 Hh(Hedgehog)是一種分泌蛋白，能夠調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物的多個(gè)發(fā)育過程。在哺乳動(dòng)物中，Hedgehog主要有三種配體，包括Dhh(Desert Hedgehog)、Shh(SonicHedgehog)和Ihh(

4、Indian Hedgehog)，三種配體都通過與Patched(Ptch)結(jié)合，將Smoothened(Smo)從Ptch的抑制狀態(tài)下解脫出來，從而阻止Glioma3(Gli3)蛋白降解成Gli3抑制狀態(tài)(Gli3R)，同時(shí)Gli2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活其轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，誘導(dǎo)Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。Hh信號(hào)通路是骨骼發(fā)育過程中極其重要的信號(hào)通路之一，Hh信號(hào)在骨折早期或者是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。大量的動(dòng)物

5、模型和細(xì)胞分子生物學(xué)研究表明，原纖毛在Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著極其重要的作用。Hh信號(hào)通路的多個(gè)相關(guān)蛋白，比如Ptc、Smo、Gli2、Gli3發(fā)現(xiàn)均存在原纖毛膜上。當(dāng)Hh配體與Ptch結(jié)合以后，Ptch順著原纖毛的軸絲從原纖毛的頂端向底端運(yùn)動(dòng)，離開原纖毛，而Smo則逆著Ptch運(yùn)動(dòng)的方向，從底端招募到原纖毛的頂端，發(fā)揮信號(hào)通路激活效應(yīng)。另外，原纖毛的結(jié)構(gòu)蛋白突變(如IFT88、IFT172、Kif3a)均可導(dǎo)致原纖毛結(jié)構(gòu)異常和Shh信號(hào)

6、的降低或丟失。
　　 骨骼發(fā)育中另外一條重要的信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路，它與Hh信號(hào)通路不同，它屬于一個(gè)分泌蛋白大家族，在人類和小鼠基因組中均有19個(gè)不同的成員。它們因結(jié)合的受體不同，參與的信號(hào)途徑也不同。整體來說，Wnt信號(hào)通路分成兩類，一類是經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，外周的信號(hào)刺激最終通過β-catenin傳遞到細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和維持成熟組織的平衡。另外的一條通路為非經(jīng)典W

7、nt信號(hào)通路，此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不需要β-catenin的參與，主要通過激活RhoA、c-JunN-terminal Kinase(JNK)的參與，調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性(planar cell polarity，PCP)和細(xì)胞的遷移。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。在成骨細(xì)胞發(fā)育早期，Wnt/β-catenin通路主要增強(qiáng)骨原細(xì)胞的增殖，抑制成骨細(xì)胞的分化;隨后，一旦早期骨原細(xì)胞形成，Wnt/β-catenin信號(hào)通路

8、則主要促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。原纖毛膜和基底體上發(fā)現(xiàn)有PCP蛋白inversin、Vangl-2的存在，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有β-catenin降解蛋白復(fù)合物成員GSK-3β和APC的存在，提示原纖毛可能參與經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。
　　 原纖毛是一類以微管為基礎(chǔ)的細(xì)胞器，突出于許多處在生長抑制期或者已分化的真核細(xì)胞表面。它與可動(dòng)纖毛同屬于纖毛（鞭毛），主要由中央軸絲以及包繞它們的質(zhì)膜構(gòu)成，微管從纖毛底部的基粒出發(fā)延伸到纖毛頂

9、端形成中央軸絲，在基粒底部則集聚成圓錐形束，深入到細(xì)胞質(zhì)中。纖毛膜則是細(xì)胞膜的延伸，許多膜蛋白都存在其上面。與可動(dòng)纖毛不同，原纖毛的中央軸絲只有外圍環(huán)繞的以兩兩連接在一起的9組微管二聯(lián)體，而中心缺少一對由中央鞘包裹的微管，形成“9+0”的微管排列。由于大量蛋白存在于纖毛膜上，使得原纖毛具有多種功能，它除了能夠起到機(jī)械感受器的作用以外，還是化學(xué)感受器，感受光和味道的刺激，同時(shí)它還能夠感受外周信號(hào)的變化并將信號(hào)通過Wnt或者是Hh信號(hào)通路，

10、傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育。原纖毛的異常能夠?qū)е露喾N疾病的發(fā)生，最為常見的包括左右體軸混亂，神經(jīng)管封閉和發(fā)育異常，多趾畸形，多囊腎病，多囊肝病，多囊胰腺，視網(wǎng)膜退化，嗅覺喪失，認(rèn)知障礙以及肥胖。骨骼細(xì)胞，比如軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，均發(fā)現(xiàn)有原纖毛的存在。在小鼠疾病模型上，原纖毛的異常，也伴隨有骨骼發(fā)育的異常。
　　 多囊腎病蛋白1(PC1)是多囊腎病蛋白基因1(Pkd1)的蛋白產(chǎn)物。它的突變能夠?qū)е?5％的病人發(fā)展成為常染

11、色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)，其余15％由多囊腎病蛋白基因2(Pkd2，PC2)突變所致。在腎小管上皮細(xì)胞上，PC1與PC2通過各自的細(xì)胞內(nèi)C-末端螺旋-螺旋區(qū)域在原纖毛上形成多囊蛋白復(fù)合物，在腎小管水流剪切力刺激下，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，從而參與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，多囊腎病蛋白1自身還參與細(xì)胞與基質(zhì)，細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。多囊腎病蛋白復(fù)合物可以在腎上皮細(xì)胞三個(gè)不同的部位發(fā)揮截然不同的功能:在基側(cè)局部粘附部位調(diào)節(jié)上

12、皮細(xì)胞的粘附和遷移;在頂側(cè)膜細(xì)胞連接部位調(diào)節(jié)分化細(xì)胞形態(tài)以及在頂膜中央原纖毛部位感受流體刺激并調(diào)節(jié)小管直徑。近來發(fā)現(xiàn)PC1在成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等重要骨骼細(xì)胞中均有較高的表達(dá)，并在小鼠胚胎Pkd1突變的模型上證實(shí)PC1與骨的發(fā)育和機(jī)械應(yīng)力感受存在密切的聯(lián)系。與腎小管上皮細(xì)胞一樣，骨細(xì)胞通過多囊腎病蛋白復(fù)合物感受機(jī)械應(yīng)力刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，從而參與骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與成骨效應(yīng)。
　　 近幾年，在骨細(xì)胞上曾經(jīng)一度

13、被人們忽略的，被視為進(jìn)化過程中殘留的細(xì)胞器——原纖毛，由于其生理多樣性作用在其他器官和組織中被一一闡明，而今在現(xiàn)代骨生物學(xué)領(lǐng)域，研究原纖毛在調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育與機(jī)械應(yīng)力感受方面的作用成為一個(gè)熱門的課題之一。在腎小管上皮細(xì)胞上與原纖毛共同作為機(jī)械感受器的多囊腎病蛋白1和2，在機(jī)械感受敏感的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞上也有較高的表達(dá)，同樣讓研究人員對其在骨骼發(fā)育中的作用也產(chǎn)生了濃厚的興趣。
　　 基于以上研究背景，本課題旨在查明原纖毛、多囊腎病蛋白

14、1在體內(nèi)和體外環(huán)境下對骨骼發(fā)育，尤其對骨的形成和骨的穩(wěn)態(tài)方面的作用。通過建立體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人的PKD1shRNA成骨細(xì)胞系，在mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平層面探討原纖毛-多囊腎病復(fù)合物對成骨形成和骨骼形成的影響;通過原纖毛結(jié)構(gòu)相關(guān)基因Kif3a和Pkd1敲除小鼠模型，從在體水平探討原纖毛、多囊腎病蛋白1對骨骼發(fā)育和形成的影響;利用Oc-Cre介導(dǎo)的Kif3a條件性敲除小鼠，將Kif3a的敲除僅局限在成熟成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中，從而組織特異性的研

15、究原纖毛在骨骼形成與骨的穩(wěn)態(tài)方面的作用，以及它們所參與的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，為臨床上防治骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病提供新的靶分子和新的治療方案，并為臨床上尋找骨修復(fù)或者新的骨生成刺激劑提供了廣闊的前景。本課題的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.在PKD1 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人的MG-63成骨細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)PKD1 mRNA表達(dá)減少，能夠影響成骨細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致成骨成熟的早期和晚期相關(guān)指標(biāo)——堿性磷酸酶的活性和鈣沉積均比對照組有明顯的

16、下降。此過程主要與細(xì)胞內(nèi)鈣水平減低，對水流剪切力的反應(yīng)降低，細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致Hh信號(hào)通路Gli蛋白降解增加，Hh信號(hào)通路受到抑制有關(guān)。
　　 2.在Kif3a和/或者Pkd1敲除小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)單純雜合子突變的Kif3a+/null小鼠和Pkd1+/null小鼠對成骨影響不一致。單純雜合子突變的Kif3a+/null小鼠成骨能力與野生型小鼠在骨密度，骨小梁面積和骨皮質(zhì)厚度沒有差別。而在單純雜合子突變的Pkd1+

17、/null小鼠上，骨密度，骨小梁面積，骨皮質(zhì)厚度均減低，說明成骨能力在此基因型小鼠中是減低的。而雙雜合子突變的Kif3a+/null;Pkd1+/null小鼠的各項(xiàng)成骨指標(biāo)基本上恢復(fù)正常，與野生型小鼠成骨能力無差別。通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR從mRNA水平發(fā)現(xiàn)，在單純雜合子突變的Kif3a+/null小鼠上，Hh/Gli2信號(hào)通路被激活;而在單純雜合子突變的Pkd1+/null小鼠上，Hh/Gli2信號(hào)通路被抑制。隨后我們通過體外原代培養(yǎng)

18、成骨細(xì)胞也證實(shí)了同樣的結(jié)果。
　　 3.在Oc-Cre介導(dǎo)的晚期成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞特異性Kif3a敲除小鼠模型上，Kif3a調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能和骨骼的形成呈現(xiàn)出一個(gè)基因敲除劑量不同效應(yīng)。一旦Kif3a敲除效率到達(dá)75％以上，導(dǎo)致成骨細(xì)胞上的原纖毛數(shù)目明顯減少和骨形成障礙。因此Kif3a缺陷在雙雜合子突變的Kif3a+/null;Pkd1+/null小鼠中表現(xiàn)出對骨骼形成的保護(hù)效應(yīng)而在Oc-Cre介導(dǎo)的條件性敲除Kif3a效率到達(dá)7

19、5％中卻轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩?yīng)。在Oc-Cre;Kif3aflox/null6周齡小鼠中，骨密度、骨骼結(jié)構(gòu)包括骨小梁、骨皮質(zhì)以及骨形成能力均明顯降低，體外培養(yǎng)從頭蓋骨分離出來的成骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞增殖能力明顯增加，成骨分化能力——堿性磷酸酶活性和鈣沉積在后期出現(xiàn)缺陷。這個(gè)影響主要跟原纖毛的丟失，定位于原纖毛上的信號(hào)通路包括Ca2+、Hh、Wnt等信號(hào)通路均受到損害有關(guān)。體外的結(jié)果也證實(shí)了從Oc-Cre;Kif3aflox/null小鼠頭蓋骨中