機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)成骨細(xì)胞功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響.pdf

1、第一部分機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞增殖分化的影響 目的：觀察機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞增殖分化的影響。 方法：人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)培養(yǎng)物保存中心(ATCC號(hào)：CRL1427)。采用根據(jù)四點(diǎn)彎曲原理設(shè)計(jì)的細(xì)胞加力裝置，分別采用不同大小應(yīng)變值的張應(yīng)力(0、1000、2000、4000、6000μstrain)以及不同的刺激時(shí)間(0、1、3、6、12h)對(duì)MG-63樣成骨細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)刺激。用α-磷

2、酸奈酚法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性；半定量RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原(COL Ⅰ)、骨鈣素(OC)、骨橋素(OPN)的mRNA的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、COLⅠ蛋白的表達(dá)；用10mmβ-甘油磷酸鈉和50μg/ml抗壞血酸誘導(dǎo)MG-63成骨樣細(xì)胞分化成熟，在這個(gè)過(guò)程中進(jìn)行力學(xué)刺激，分別在第18天和第24天，用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成。 結(jié)果：當(dāng)應(yīng)變值為2000μstrain時(shí)，力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)

3、胞PCNA蛋白表達(dá)以及ALP活性的促進(jìn)作用最強(qiáng)。當(dāng)應(yīng)變值為2000μstrain時(shí)，力學(xué)刺激呈時(shí)間依賴(lài)性明顯上調(diào)了MG-63成骨樣細(xì)胞PCNA蛋白、ALP活性、COL Ⅰ蛋白及mRNA、OC mRNA、OPN mRNA的表達(dá)；茜素紅染色結(jié)果顯示，力學(xué)刺激組較對(duì)照組更加容易形成礦化結(jié)節(jié)。 結(jié)論：適宜的機(jī)械力學(xué)刺激促進(jìn)了MG-63成骨樣細(xì)胞增殖分化指標(biāo)如PCNA、ALP、COL Ⅰ、OC及OPN等的表達(dá)，說(shuō)明機(jī)械力學(xué)刺激在成骨細(xì)胞增

4、殖分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 第二部分機(jī)械應(yīng)力對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)影響及機(jī)制研究 目的：觀察機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞C17GF表達(dá)的影響，對(duì)絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路(包括ERK、JNK及p38)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT的影響以及MAPK、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用。

5、 方法：用免疫印跡法及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CTGF蛋白的表達(dá)。MAPK、AKT信號(hào)通路的活化也采用免疫印跡法檢測(cè)。CTGFmRNA表達(dá)采用半定量RT-PCR檢測(cè)。 結(jié)果：機(jī)械力學(xué)刺激促進(jìn)了MG-63成骨樣細(xì)胞CTGF的表達(dá)，且力學(xué)刺激能夠激活ERK及JNK信號(hào)通路，但對(duì)不能使p38信號(hào)通路激活。JNK信號(hào)通路阻斷劑能夠阻斷應(yīng)力刺激對(duì)CTGF上調(diào)作用。應(yīng)力刺激不能激活A(yù)KT 信號(hào)通路，但P13K信號(hào)通路阻斷劑阻斷了力學(xué)刺激

6、對(duì)JNK的活化，并且也阻斷了力學(xué)刺激對(duì)CTGF表達(dá)的促進(jìn)作用。 結(jié)論：機(jī)械力學(xué)刺激通過(guò)JNK依賴(lài)的信號(hào)途徑促進(jìn)了MG-63成骨樣細(xì)胞CTGF的表達(dá)，并且P13K-JNK途徑在這一過(guò)程中起重要作用。 第三部分機(jī)械應(yīng)力刺激對(duì)OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的影響 目的：觀察力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞護(hù)骨素(osteoprotegrin，OPG)及細(xì)胞核因子-кB受體活化因子配體(receptor activato

7、r ofnuclear factor kappa B ligand，RANKL)的表達(dá)，以及對(duì)小鼠前破骨細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞核因子-кB受體活化因子(receptor activator ofnuclear factor kappa B，RANK)表達(dá)的影響；觀察MAPK信號(hào)通路在力學(xué)刺激引起的OPG表達(dá)中的作用；觀察力學(xué)刺激對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠前破骨細(xì)胞RAW264.7分化的影響。 方法：用免疫印跡法檢測(cè)MG-63成骨樣

8、細(xì)胞OPG、RANKL及小鼠前破骨細(xì)胞RAW264.7 RANK蛋白的表達(dá)。用半定量RT-PCR檢測(cè)MG-63成骨樣細(xì)胞OPG mRNA的表達(dá)。用50 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞6天后，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞(即破骨細(xì)胞)。 結(jié)果：機(jī)械力學(xué)刺激明顯促進(jìn)了MG-63成骨樣細(xì)胞OPG蛋白及mRNA的表達(dá)，但對(duì)RANKL蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。力學(xué)刺激能夠激活ERK及JNK信號(hào)

9、通路，但對(duì)不能使p38信號(hào)通路激活。ERK信號(hào)通路阻斷劑能夠阻斷力學(xué)刺激引起的OPG蛋白的表達(dá)。力學(xué)刺激對(duì)小鼠前破骨細(xì)胞RAW64.7 RANK蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯作用，但力學(xué)刺激能夠顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的前破骨細(xì)胞RAW264.7的分化成熟。 結(jié)論：機(jī)械力學(xué)刺激促進(jìn)了MG-63成骨樣細(xì)胞OPG的表達(dá)，并且能夠抑制前破骨細(xì)胞RAW264.7向成熟破骨細(xì)胞的分化，這可能是力學(xué)刺激能夠促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的機(jī)制之一。 第四

10、部分Integrinβ1/FAK在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用 目的：觀察整合素-β<,1>(Integrin-β1)在MG-63成骨樣細(xì)胞增殖分化過(guò)程中表達(dá)的變化。觀察機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)MG-63成骨樣細(xì)胞Integrin-β<,1>表達(dá)，以及對(duì)粘著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號(hào)途徑的影響。觀察力學(xué)刺激對(duì)Integrin-β<,1>及FAK之間相互作用的影響，以及Integrin-β<,1>是否介導(dǎo)了力學(xué)

11、刺激對(duì)FAK及ERK的活化過(guò)程。 方法：Imegrin-β<,1>蛋白表達(dá)及FAK信號(hào)途徑活化程度采用免疫印跡法檢測(cè)。Integrin-β<,1> mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。用細(xì)胞免疫熒光染色顯示FAK。用免疫共沉淀法檢測(cè)Integrin-β<,1>與FAK的相互作用。 結(jié)果：在MG-63成骨樣細(xì)胞增殖分化過(guò)程中，Integrin-β<,1>的表達(dá)呈現(xiàn)雙峰式表達(dá)，即在增殖末期及礦化期表達(dá)明顯增高。機(jī)械力學(xué)刺激