Cofilin在成骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、正常骨骼處于一個(gè)吸收與重建的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中,其中力刺激是維持平衡的基礎(chǔ)。不斷有研究證實(shí),牽張應(yīng)力是有效促進(jìn)成骨活性和功能的力學(xué)刺激。體內(nèi)外力刺激通過多種途徑被成骨細(xì)胞所感知,通過一系列的級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng),成骨細(xì)胞將力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號,進(jìn)一步調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平,同時(shí)合成各種活性物質(zhì)及酶類,最終使得機(jī)體表現(xiàn)出各種復(fù)雜的生理及病理活動(dòng)。多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,細(xì)胞骨架作為首先感受力學(xué)刺激的結(jié)構(gòu),發(fā)揮著重要作用。成骨細(xì)胞對外源性機(jī)械力信號的反

2、應(yīng)主要是由F-actin來響應(yīng)的,F-actin通過與跨膜分子相互作用而成為跨膜力信號傳遞的主要環(huán)節(jié)。而成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的改建依賴于一些對力學(xué)敏感的關(guān)鍵蛋白的調(diào)控作用。ADF/Cofilin家族蛋白是actin結(jié)合蛋白中獨(dú)一無二的解聚微絲的蛋白群,其對肌動(dòng)蛋白發(fā)揮著重要調(diào)控作用:當(dāng)肌動(dòng)蛋白絲激活時(shí),ADF/Cofilin家族蛋白能夠切斷肌動(dòng)蛋白絲,增加肌動(dòng)蛋白單體在肌絲末端的解聚合。這提示我們Cofilin在細(xì)胞骨架力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號中發(fā)揮著

3、重要作用。而以往的研究主要集中在內(nèi)皮、神經(jīng)、肌肉細(xì)胞中,對于成骨細(xì)胞的研究尚未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)通過Flexcell應(yīng)力加載系統(tǒng),對人成骨樣細(xì)胞(MG-63)施以不同加載時(shí)長的周期性牽張力,通過免疫熒光、RT-PCR、Western Blot、基因沉默等技術(shù),探討MG-63細(xì)胞受牽張力刺激后Cofilin的表達(dá)情況,以及在Cofilin正常表達(dá)與Cofilin抑制后,對上下游的成骨目的基因的影響,從而探討Cofilin在機(jī)械力學(xué)

4、刺激下細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,為骨力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供新的依據(jù),為縮短牽張成骨時(shí)程、加速骨缺損修復(fù)開辟新的思路,并為篩選治療骨代謝失衡相關(guān)疾病的藥物提供新靶點(diǎn)。
　　1.牽張應(yīng)力下Cofilin在成骨細(xì)胞中表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:應(yīng)用機(jī)械牽張應(yīng)力加載人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63,通過觀察和測定絲切蛋白(Cofilin)的表達(dá)和含量變化情況,初步探討Cofilin在牽張應(yīng)力引起的MG-63細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用。
　　

5、方法:將MG-63分為加力組與對照組,對照組不加力,采用Flexcell牽張應(yīng)力加載系統(tǒng),用12％大小的應(yīng)力值進(jìn)行力學(xué)刺激1、4、8、12、24h后,用免疫熒光染色觀察Cofilin的變化,RT-PCR檢測CofilinmRNA水平的變化,Western-Blot測定細(xì)胞內(nèi)Cofilin的含量。
　　結(jié)果:MG-63細(xì)胞受應(yīng)力刺激后,1、4h細(xì)胞內(nèi)Cofilin染色逐漸增強(qiáng),8、12、24h細(xì)胞內(nèi)Cofilin染色逐漸減弱,但仍明

6、顯高于對照組。而應(yīng)力作用下CofilinmRNA水平無明顯變化(p>0.05)。WesternBlot顯示,加載后1hCofilin含量增高(p<0.05),4h時(shí)細(xì)胞內(nèi)Cofilin含量達(dá)到高峰(p<0.05),8、12、24hCofilin含量逐漸減少,但仍明顯高于對照組(p<0.05)。
　　結(jié)論:機(jī)械牽張應(yīng)力刺激可明顯上調(diào)Cofilin表達(dá),且具有時(shí)間依賴性,提示其可能在成骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮一定的作用。
　

7、　2.構(gòu)建Cofilin蛋白低表達(dá)模型
　　目的:為了進(jìn)一步明確Cofilin的作用,本實(shí)驗(yàn)采取shRNA干擾載體構(gòu)建Cofilin低表達(dá)模型,為下一步實(shí)驗(yàn)明確應(yīng)力下Cofilin正常表達(dá)以及干擾后Cofilin對成骨分化及成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。
　　方法:委托公司設(shè)計(jì)Cofilin基因沉默的不同shRNA片段,通過對MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后CofilinmRNA水平

8、變化,Westernblot測定細(xì)胞內(nèi)Cofilin的含量。
　　結(jié)果:4個(gè)干擾片段在mRNA水平上明顯降低了Cofilin的水平(p<0.05),但各片段之間無明顯差異(p>0.05)。Western blot結(jié)果顯示,1號和4號片段明顯下調(diào)了Cofilin的含量(p<0.001)。
　　結(jié)論:1號與4號shRNA干擾載體可明顯抑制Cofilin的表達(dá),且效果穩(wěn)定。
　　3.Cofilin對機(jī)械應(yīng)力引起的成骨細(xì)胞成骨

9、效應(yīng)的影響
　　目的:通過觀察正常表達(dá)Cofilin的成骨樣細(xì)胞與抑制表達(dá)Cofilin成骨樣細(xì)胞在機(jī)械力學(xué)刺激下對成骨分化及成骨相關(guān)基因的mRNA水平的影響,從而明確Cofilin在機(jī)械力學(xué)刺激成骨中的作用,探討Cofilin在促進(jìn)機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞成骨效應(yīng)的上下游分子機(jī)理,為成骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供新的證據(jù)。
　　方法:細(xì)胞分為Cofilin正常表達(dá)與Cofilin抑制組,正常表達(dá)組分組方式與加力方式均同實(shí)驗(yàn)一,

10、Cofilin抑制組采用實(shí)驗(yàn)二中篩選出的1號干擾片段,創(chuàng)建模式同實(shí)驗(yàn)二,加力組分組方法同實(shí)驗(yàn)一,對照組為不干擾,不加力。力學(xué)加載完成后采用Realtime-PCR方法檢測成骨及成骨分化的目的基因ALP、OCN、COL1、Runx-2mRNA水平的變化。
　　結(jié)果:Cofilin正常表達(dá)組在力學(xué)刺激后ALP、OCN、COL1、Runx-2基因的mRNA水平有明顯變化,均顯著高于對照組(p<0.05),Cofilin抑制后,機(jī)械力學(xué)刺