Hedgehog 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在體外誘導(dǎo)大鼠基質(zhì)干細(xì)胞成軟骨和成骨細(xì)胞過程中作用的研究.pdf

1、目前，由于機(jī)械、外力或自身因素引起的骨及軟骨損傷已成為臨床治療的主要病癥之一。現(xiàn)階段利用組織工程進(jìn)行骨修復(fù)是骨組織缺損治療的熱點(diǎn)和發(fā)展方向。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchy stem cell，BMSCs)作為一類存在于骨髓中的非造血多能干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化的特性，而且來源廣、取材簡便、免疫排斥反應(yīng)弱、遺傳背景穩(wěn)定，已成為組織工程中首選的種子細(xì)胞。許多研究已經(jīng)證實(shí)，BMSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞

2、等多種細(xì)胞，因而被廣泛應(yīng)用于治療骨組織缺損。但是BMSCs向成骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件尚無標(biāo)準(zhǔn)，常用的成骨誘導(dǎo)劑是地塞米松，軟骨誘導(dǎo)劑是TGF-β1。
　　在脊椎動(dòng)物中，Hedgehog(Hh)蛋白家族包括3個(gè)成員:Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Dersert Hedgehog(DHH)。SHH與細(xì)胞在肢體、體節(jié)、神經(jīng)管發(fā)育中的分化建立有關(guān)，IHH特征性地參與軟骨發(fā)育，D

3、HH在生殖細(xì)胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。Hedgehog信號通路不但在骨組織發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用，也可以促進(jìn)成骨相關(guān)細(xì)胞的分化。
　　BMSCs在骨髓中含量很少并且迄今為止仍未篩選到它的特異性分子標(biāo)記，在體外培養(yǎng)的環(huán)境中如何提純并富集BMSCs問題還沒有解決。而且在高等動(dòng)物體內(nèi)，Hedgehog在骨、軟骨發(fā)育中的作用機(jī)制研究較清楚，但其在骨組織工程中(由種子細(xì)胞定向分化為軟骨和骨細(xì)胞的過程)的作用及機(jī)理尚不清楚。因此，本文采用貼壁

4、分離法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用含有地塞米松的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，用含TGF-β1的軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化。采用RT-PCR、免疫組化及Western Blotting等方法檢測分析BMSCs向成骨、軟骨分化過程中信號分子SHH和IHH在蛋白水平以及基因水平的表達(dá)變化，以探討Hedgehog信號分子在體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化和軟骨分化過程中的作用。
　　本研究主要有以下研究結(jié)果:
　　1、利用直接貼壁

5、分離法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，比較四種培養(yǎng)環(huán)境發(fā)現(xiàn)，用進(jìn)口胎牛血清和DMEM-L培養(yǎng)液培養(yǎng)于一次性塑料培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長狀態(tài)最好、細(xì)胞增殖速度最快。傳至第3代，即可見絕大數(shù)細(xì)胞為長梭形的成纖維樣細(xì)胞，呈漩渦狀生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代細(xì)胞CD44和CD34的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有CD44的細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的90.16％，而含有CD34的細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的2.27％。
　　2、地塞米松誘導(dǎo)7d、14d、21d后，I型膠原陽性表達(dá)率逐漸升高

6、，且從14d開始陽性率高于90％。SHH蛋白在誘導(dǎo)組較同時(shí)段未誘導(dǎo)組表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長SHH蛋白的表達(dá)量先升后降，其中14d時(shí)SHH表達(dá)量最高。IHH蛋白在誘導(dǎo)組表達(dá)量顯著低于未誘導(dǎo)組(P＜0.05)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長 IHH蛋白的表達(dá)量無顯著變化。在MSCs誘導(dǎo)成成骨過程中Shh基因和Ihh基因的表達(dá)無顯著性變化(P＞0.05)。
　　3、TGF-β1誘導(dǎo)7d、14d、21d后，Ⅱ型膠原陽性表達(dá)

7、率逐漸升高，從14d開始陽性率高于90％。SHH蛋白在誘導(dǎo)組較同時(shí)段未誘導(dǎo)組表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長SHH蛋白的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)。IHH蛋白在誘導(dǎo)14d和21d時(shí)表達(dá)量較未誘導(dǎo)組顯著增高(P＜0.05)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長 IHH蛋白的表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)。Shh基因表達(dá)量的變化趨勢與SHH蛋白的相似。Ihh基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)7d和14d時(shí)顯著低于未誘導(dǎo)組(P＜0.05)，且Ihh基

8、因隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長表達(dá)呈增加趨勢，誘導(dǎo)21d后顯著增加(P＜0.05)。
　　鑒于上述一系列新發(fā)現(xiàn)，可以得出以下主要結(jié)論:
　　1、貼壁分離法分離BMSCs后，用進(jìn)口胎牛血清和DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)于一次性進(jìn)口塑料培養(yǎng)皿的方法獲得BMSCs的效率高、純度高，可直接用于后續(xù)研究。
　　2、誘導(dǎo)組Ⅰ型膠原免疫反應(yīng)呈陽性結(jié)果表明，地塞米松能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)組中，SHH蛋白表達(dá)較未誘導(dǎo)組顯著升高，IHH蛋白

9、的表達(dá)較未誘導(dǎo)組顯著降低，即SHH蛋白與成骨細(xì)胞分化呈正相關(guān)，IHH呈負(fù)相關(guān)，表明SHH、IHH以不同的作用方式參與間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞的過程。
　　3、誘導(dǎo)組Ⅱ型膠原免疫反應(yīng)呈陽性結(jié)果表明，TGF-β1能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)組中，SHH蛋白表達(dá)較未誘導(dǎo)組顯著降低，IHH蛋白表達(dá)在誘導(dǎo)14d后較未誘導(dǎo)組顯著升高，即SHH蛋白與成軟骨細(xì)胞分化呈負(fù)相關(guān)，IHH呈正相關(guān)，表明SHH、IHH以不同的作用方式參與間充質(zhì)

10、干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的過程。
　　綜上所述，本文首次系統(tǒng)的研究Hedgehog信號途徑主要分子(SHH、IHH)在BMSCs定向分化為軟骨和骨細(xì)胞的過程中的作用及機(jī)理。研究結(jié)果顯示在成骨誘導(dǎo)分化過程中，SHH蛋白的表達(dá)顯著升高，IHH蛋白的表達(dá)顯著降低；在軟骨誘導(dǎo)分化過程中，SHH蛋白的表達(dá)顯著降低，IHH蛋白的表達(dá)顯著升高，表明在BMSCs定向分化為軟骨和骨細(xì)胞的過程中，可能存在不同SHH信號、IHH信號表達(dá)模式，本研究將為闡明