人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中Notch信號(hào)的初步研究.pdf

1、目的:
　　探討 Notch信號(hào)通路在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　1.hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用酶消化法從人臍帶中分離hUC-MSCs,體外培養(yǎng)擴(kuò)增;倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)特征;MTT法制作細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn);流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞表面標(biāo)志;

2、茜素紅染色、甲苯胺藍(lán)染色和油紅O染色分別檢測(cè)細(xì)胞成骨、成軟骨和成脂分化能力。
　　2.hUC-MSCs中Notch信號(hào)的研究:收集第3代hUC-MSCs,體外誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化;甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色分別鑒定蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)和Ⅱ型膠原蛋白(Collagen TypeⅡ,COL-2A1),阿利新藍(lán)法和羥脯氨酸法分別檢測(cè)它們的含量;qPCR分別檢測(cè)GAG、COL-2A1以及Notch信號(hào)分子

3、Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1的基因表達(dá)水平;Western-Blot檢測(cè)Notch-1蛋白的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　3.Notch信號(hào)在hUC-MSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用研究:收集第3代hUC-MSCs,體外誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化的同時(shí)用不同濃度的Notch信號(hào)特異性阻斷劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-(S)-phenylglycine

4、t-butyl ester(DAPT)處理;倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)特征;MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色分別鑒定GAG和COL-2A1,阿利新藍(lán)法和羥脯氨酸法分別檢測(cè)它們的含量;qPCR分別檢測(cè)GAG、COL-2A1以及Notch信號(hào)分子的基因表達(dá)水平;Western-Blot檢測(cè)Notch-1蛋白的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:
　　1.酶消化法從人臍帶中分離獲得的細(xì)胞體外培養(yǎng)至第3

5、代時(shí),其形態(tài)基本為間充質(zhì)干細(xì)胞典型的長(zhǎng)梭形,且第4、5代的形態(tài)基本不變;第3代細(xì)胞的增殖能力強(qiáng),生長(zhǎng)迅速,約有25.4％的細(xì)胞處于分裂的G2/S期,而凋亡率僅為6%;細(xì)胞CD13、CD44和CD105的陽(yáng)性率分別為100%、100%和99.9%,而CD11b、CD34、CD45以及HLA-DR的陰性率分別為0.01%、0.02%、0.01%和0.01%,并具有成骨、成軟骨和成脂分化能力。
　　2.與無(wú)添加誘導(dǎo)劑的對(duì)照組相比,誘導(dǎo)組

6、的甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色均呈陽(yáng)性,且染色隨著時(shí)間逐漸加深;在第6天、12天和18天,GAG的含量分別為12.39±1.39μg/ml、18.66±1.88μg/ml、25.91±4.08μg/ml,COL-2A1的含量分別為97.18±9.84μg/ml、117.2±3.75μg/ml、195.64±3.31μg/ml;qPCR結(jié)果顯示GAG和COL-2A1的基因表達(dá)水平隨著時(shí)間也逐漸增加,而Jag-1、PS-1、Notch-1和H

7、es-1的基因表達(dá)水平明顯下降(p<0.01);Western-Blot結(jié)果顯示Notch-1蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間逐漸下降,而處于分裂靜止G1期的細(xì)胞比例逐漸上升,分別為70.9%、77.9%和90%。
　　3.誘導(dǎo)組、DMSO組和各濃度DAPT組的細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變成接近軟骨細(xì)胞的多邊形,MTT結(jié)果顯示各組的細(xì)胞數(shù)量在第5天達(dá)到頂峰;各組的甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色均呈陽(yáng)性,且染色隨著時(shí)間逐漸加深;各組GAG和COL-2A1的

8、含量測(cè)定以及基因表達(dá)水平檢測(cè)也表明GAG和COL-2A1的表達(dá)隨著時(shí)間逐漸增加,且在第18天,誘導(dǎo)組、DMSO組以及0.5μM、1μM和5μM DAPT組的GAG含量分別為25.91±4.08μg/ml、26.89±1.31μg/ml、21.13±0.92μg/ml、17.63±0.18μg/ml、16.23±0.32μg/ml,COL-2A1含量分別為195.64±3.31μg/ml、203.42±7.31μg/ml;208.12±1

9、3.65μg/ml、185±1.94μg/ml、139.36±4.63μg/ml;qPCR結(jié)果顯示,與誘導(dǎo)組相比,各濃度DAPT組Notch信號(hào)分子的基因表達(dá)水平都下降;Western-Blot結(jié)果顯示誘導(dǎo)組、DMSO組和各濃度DAPT組Notch-1蛋白的表達(dá)水平隨著時(shí)間下降,且各濃度DAPT組下降更明顯,而各組第18天G1期的細(xì)胞比例分別為90%、91.9%、88.5%、87.9%和87%。
　　結(jié)論:
　　1.酶消化法

10、從人臍帶中分離獲得的細(xì)胞活性好,純度高,生長(zhǎng)迅速,增殖旺盛,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征,可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究;
　　2.Notch信號(hào)通路存在于hUC-MSCs中,它可保持細(xì)胞的增殖活性,一旦誘導(dǎo)hUC-MSCs向軟骨細(xì)胞分化,Notch信號(hào)表達(dá)水平下降;
　　3.本課題中hUC-MSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的Notch信號(hào)表達(dá)水平可能比較適合GAG的表達(dá),但還不是COL-2A1表達(dá)的最佳水平,進(jìn)一步適當(dāng)降低Notch信號(hào)表達(dá)水平