動態(tài)壓應(yīng)力對IGF-1誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞軟骨分化的影響和ERK在細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用.pdf

1、本文主要分三部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分動態(tài)壓應(yīng)力對前軟骨干細(xì)胞 Sox9和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響
　　目的：
　　研究間斷性動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠前軟骨干細(xì)胞 Sox9及軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)(Ⅱ型膠原和aggrecan)表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.分離原代大鼠前軟骨干細(xì)胞并接種于培養(yǎng)基中;
　　2.細(xì)胞免疫磁珠分選純化體外培養(yǎng)的前軟骨干細(xì)胞(PSCs);
　　3.將體外培養(yǎng)的PSCs

2、隨機(jī)分為4組:對照組、壓力1天組、壓力3天組和壓力7天組,使用自行設(shè)計制備的細(xì)胞壓力裝置對細(xì)胞進(jìn)行間斷性(1d刺激12h,分別1d,3d和7d)的壓應(yīng)力刺激(90mmHg),未壓力組為對照組;
　　4.采用熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組細(xì)胞的Sox9和Ⅱ型膠原和aggrecan的基因表達(dá)情況;
　　5.Western-blot檢測細(xì)胞 Sox9和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平并進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.倒置相差顯微

3、鏡下見細(xì)胞形態(tài)多為為三角形或多角形,生長良好。
　　2.前軟骨干細(xì)胞在90 mmHg強(qiáng)度的動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)條件下,壓力組各時間點 Sox9、aggrecan和Ⅱ型膠原的基因表達(dá)水平明顯增加并高于對照組(P<0.05);
　　3.1d壓力組 Sox9和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異(P>0.05),3d和7d時間點的蛋白表達(dá)增加并高于對照組(P<0.05);
　　4.Sox9和Ⅱ型膠原基因和蛋白表達(dá)水平以及aggrec

4、an基因表達(dá)都隨著壓應(yīng)力刺激時間增加而增加。
　　結(jié)論：
　　間斷性動態(tài)壓應(yīng)力可以明顯增加大鼠前軟骨干細(xì)胞 Sox9、Ⅱ型膠原和aggrecan的表達(dá),可能會促進(jìn)前軟骨干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。
　　第二部分動態(tài)壓應(yīng)力對胰島素樣生長因子-1誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞Sox9和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響
　　目的：
　　研究動態(tài)壓應(yīng)力對胰島素樣生長因子-1誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞 Sox9和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。
　　方法：

5、>　　1.常規(guī)體外培養(yǎng)前軟骨干細(xì)胞并分離純化;
　　2.將純化后的前軟骨干細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶中,隨機(jī)分為4組:對照組、壓力組、IGF-1組合壓力復(fù)合 IGF-1組。壓力組予以90mmHg強(qiáng)度的壓應(yīng)力,IGF-1組予以 IGF-1,終濃度為100ng/ml;對照組不施加壓力,也不加入 IGF-1;
　　3.光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變以及阿利新藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色;
　　4.實時熒光定量PCR方法檢測前軟骨干細(xì)胞中Sox

6、9和軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.分選后的前軟骨干細(xì)胞呈三角形或梭形,折光性好;誘導(dǎo)后細(xì)胞由梭形逐漸變?yōu)槎嘟切位蝾悎A形,細(xì)胞突起逐漸變短。
　　2.阿利新藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示 IGF-1組陽性反應(yīng),壓力組呈弱陽性而壓力復(fù)合 IGF-1組介于兩者之間;
　　3.壓力組、IGF-1組合復(fù)合組中Sox9、和Ⅱ型膠原的基因表達(dá)水平明顯增加并高于對照組(P<0.05);壓力復(fù)合 IGF-1

7、組中Sox9、aggrecan和Ⅱ型膠原基因表達(dá)低于 IGF-1組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　長期間斷恒定的動態(tài)壓應(yīng)力對 IGF-1誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞 Sox9和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)有抑制作用,可能會抑制IGF-1調(diào)控的軟骨分化。
　　第三部分 ERK信號通路在前軟骨干細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)信號傳導(dǎo)中的作用
　　目的：
　　探討 ERK信號通路在前軟骨干細(xì)胞響應(yīng)力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。
　　方法：<

8、br>　　1.常規(guī)體外培養(yǎng)前軟骨干細(xì)胞并分離純化;
　　2.將純化后的前軟骨干細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶中,隨機(jī)分為2組:對照組和壓力組,壓力組予以90mmHg強(qiáng)度的壓應(yīng)力,持續(xù)24h;每組分為兩個小組:空白組和抑制劑組,抑制劑組中加入 PD98059,終濃度為20μmol/L;共4個組。
　　3.實時熒光定量 PCR方法檢測前軟骨干細(xì)胞中Sox9和Ⅱ型膠原基因表達(dá)情況;
　　4.Western-blot檢測細(xì)胞 Sox9和Ⅱ型

9、膠原蛋白表達(dá)水平并進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.前軟骨干細(xì)胞在90 mmHg強(qiáng)度的動態(tài)壓應(yīng)力培養(yǎng)條件下,壓力組 pERK蛋白表達(dá)水平要高于對照組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
　　2.qPCR和Western-blot顯示 Sox9和Ⅱ型膠原的基因和蛋白表達(dá)水平明顯增加并高于對照組(P<0.05);但壓應(yīng)力誘導(dǎo)的Sox9和Ⅱ型膠原的基因表達(dá)水平升高可被 PD98059抑制。
　　3.加入 PD98059后,對