誘導(dǎo)前軟骨干細(xì)胞向成軟骨方向定向分化的機(jī)制及其體內(nèi)構(gòu)建骺板的研究.pdf

1、研究目的 建立PSC<,s>的分離純化方法及PSC<,s>細(xì)胞庫,探討TGFβ(transforming growth factorβ)誘導(dǎo)PSC<,s>向成軟骨方向定向分化的可行性及特異性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)機(jī)制;評(píng)價(jià)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因修飾PSC<,s>的效果及其與骨基質(zhì)明膠(BMG)復(fù)合物異位移植的成軟骨能力;探討藻酸鹽水凝膠(alginate hydrogel,AH)與PSC<,s>復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建骺板樣組織的可行性

2、.研究方法 利用磁性細(xì)胞分選術(shù)分離純化有FGFR-3表面標(biāo)志的骨骺PSC<,s>,用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、免疫組化、免疫熒光等技術(shù)鑒定純化后的PSC<,s>.將PSC<,s>體外擴(kuò)增至第3代,采用液氮深低溫保存細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR、免疫組化免疫熒光等技術(shù)定期對(duì)復(fù)蘇PSC<,s>行生物學(xué)特性鑒定.采用藻酸鹽凝膠培養(yǎng),分別以TGFβ3誘導(dǎo)分離純化的PSC<,s>向成軟骨方向分化,應(yīng)用免疫組化、RT-PCR、免疫沉淀、western bl

3、ot和分光光度等技術(shù)測(cè)定PSC<,s>向成軟骨方向分化過程中特異性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá).用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將EGFP基因表達(dá)載體pEGFP轉(zhuǎn)染PSC<,s>,G418篩選得到EGFP基因修飾PSC<,s>,將EGFP基因修飾PSC<,s>與BMG復(fù)合體體外培養(yǎng)后植入大鼠體內(nèi),熒光顯微鏡下定期觀察復(fù)合體GFP表達(dá),免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá).用多聚賴氨酸和藻酸鹽制備AH,將PSC<,s>在含有TGF-β3的藻酸鹽微珠中培養(yǎng),分別于7、14、

4、21d將被誘導(dǎo)的PSC<,s>包埋入AH制備成AH-PSC<,s>復(fù)合物;分別將AH-PSC<,s>自體植入大鼠背部肌肉中,定期取材測(cè)定移植物的重量、細(xì)胞數(shù),并行組織學(xué)檢查及Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè).研究結(jié)論 磁性細(xì)胞分選術(shù)可有效地分離純化PSC<,s>.可用液氮深低溫保存的方法建立新生大鼠PSC<,s>細(xì)胞庫.TGFβ能誘導(dǎo)PSC<,s>向成軟骨方向定向分化,此分化過程伴隨特異性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積.EGFP基因修飾PSC<,s>在體