微絲在成骨細胞力學敏感性恢復(fù)中的作用.pdf

1、骨組織的大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到力學刺激的調(diào)控。成骨細胞,作為骨組織內(nèi)的力學感應(yīng)單元之一,對存在于骨組織中流體剪應(yīng)力(FSS)刺激具有力學敏感性,并在FSS刺激作用下對骨組織產(chǎn)生促生成的作用。近期的研究表明,骨組織在持續(xù)的力學加載中逐漸的丟失對力學刺激的敏感性,而插入的間歇時間能夠促使其力學敏感性恢復(fù),但相關(guān)細胞水平的機理尚不明了。結(jié)合成骨細胞細胞骨架中的微絲(F-actin)與細胞內(nèi)鈣離子信號的雙向調(diào)控作用,本文設(shè)F-actin強度

2、在成骨細胞受到單向穩(wěn)定流體剪應(yīng)力(sFSS)加載后力學敏感性的恢復(fù)過程中起主導作用。
　　為了驗證這一設(shè)想,我們首先使用MC3T3-E1成骨細胞以及骨髓充間質(zhì)干細胞(BMSCs)作為研究對象,并對其進行10dyn/cm2的sFSS加載,在休息不同的時間(0,10以及30分鐘)后對其進行再次加載。我們發(fā)現(xiàn)在加載后插入30分鐘的間歇時間能夠使得兩種細胞的力學敏感性得到恢復(fù)。通過使用MC3T3-E1細胞作為重點研究對象,對其進行3分鐘s

3、FSS加載,在休息0,10以及30分鐘后對其進行再次進行相同的sFSS加載,我們發(fā)現(xiàn)插入長期間歇時間的加載相對于插入短期間歇時間的加載以及持續(xù)加載的力學加載在堿性磷酸酶活性的提升上作用較明顯,且細胞的力學的敏感性呈先下降后升高的趨勢:細胞在休息0,10以及30分鐘后相對第一次加載的鈣峰倍數(shù)增加分別恢復(fù)了0％,79.7%以及112.2%,而響應(yīng)率分別恢復(fù)了0%,37.5%以及137.5%。通過結(jié)合使用阻滯劑對力學敏感型通道進行阻斷的實驗數(shù)

4、據(jù),我們發(fā)現(xiàn)力學敏感型通道的開放程度在此過程中起主導作用:細胞中力學敏感型通道在第一次加載時以及不同間歇時間(0,10以及30分鐘)后對鈣離子信號鈣峰倍數(shù)增加的貢獻率分別為48%,0%,33.3%以及57.6%;對響應(yīng)率的貢獻率分別為27.3%,0%,18.5%以及41.9%。通過對相應(yīng)時間點細胞中F-actin進行染色,我們發(fā)現(xiàn)首次加載后F-actin的強度呈先上升后下降的趨勢;(細胞中連續(xù)的F-actin的密度由加載前的8.21±4

5、.25升高至sFSS加載后的15.25±2.26,加載后休息10分鐘后細胞中F-actin的密度顯著增加為35.28±1.91,隨著間歇時間延長至30分鐘,F-actin的密度降低至15.33±1.23)。結(jié)合鬼筆環(huán)肽(Phalloidin(Phall)),一種F-actin的穩(wěn)定劑對F-actin聚合/解聚合作用的抑制后測得的鈣離子信號數(shù)據(jù),我們認為,成骨細胞細胞骨架中的F-actin通過調(diào)控成骨細胞中力學敏感型通道開放程度參與了細胞

6、力學敏感性的恢復(fù)。
　　為了進一步驗證細胞骨架中微絲對成骨細胞力學敏感性調(diào)控作用,我們使用前列腺素E2(PGE2),一種具有促進骨生成作用的調(diào)控分子對成骨細胞進行處理,研究其對細胞力學敏感性的調(diào)控作用。既往研究表明,PGE2能夠促進靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細胞DNA合成以及細胞增殖,但截至目前,其在處于加載過程的成骨細胞中的作用尚不明了。通過結(jié)合PGE2在骨組織中的促生成作用與成骨細胞力學敏感性的調(diào)控過程,我們發(fā)現(xiàn),dmPGE2能夠顯著的提

7、高細胞對后續(xù)sFSS加載的[Ca2+]i響應(yīng)(dmPGE2處理組1.57±0.37以及86.5±9.3%vs.空白組中的1.26±0.53以及16.3±8.4%)。結(jié)合本文中Phall對dmPGE2誘導的細胞力學敏感性恢復(fù)的抑制作用(Phall處理組1.28±0.2以及45.7±22.3%vs.dmPGE2處理組1.57±0.37以及86.5±9.3%),我們認為F-actin同樣在細胞力學敏感性的調(diào)控過程中起參與作用。在后續(xù)的實驗中,

8、我們使用dmPGE2對受到sFSS加載后的細胞中F-actin的變化進行研究,發(fā)現(xiàn)dmPGE2能夠加速F-actin強度的降低過程。通過使用8溴-環(huán)單磷酸腺苷(8br-cAMP,一種PKA信號通路的激活劑)以及蛋白激酶A寡肽阻滯劑(PKI)對受到sFSS加載后的細胞中F-actin的變化進行研究,我們發(fā)現(xiàn)8br-cAMP能夠模擬dmPGE2對F-actin的調(diào)控作用,而PKI抑制了dmPGE2的作用。因此,我們推斷PGE2通過加快細胞骨

9、架中F-actin強度的恢復(fù)過程,降低細胞硬度,增加力學敏感型通道的開放程度的途徑來恢復(fù)細胞的力學敏感性,進而提升骨生成作用;而PKA信號通路參與了該調(diào)控過程。
　　綜上所述,本文的研究結(jié)果表明,成骨細胞中的F-actin能夠通過調(diào)控力學敏感型通道的開放來調(diào)控細胞在sFSS加載后以及PGE2藥物處理過程中的力學敏感性。本文的結(jié)論能夠為解答成骨細胞力學敏感性的丟失以及PGE2在骨組織中的促生成作用提供重要的理論依據(jù);并且為骨生成相關(guān)