脫氧核酶在逆轉(zhuǎn)具有MDR表型腫瘤細胞化療敏感性作用的研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的一個主要機制是編碼P-糖蛋白的多藥耐藥基因MDR1。P-糖蛋白是一種能量依賴性的藥物輸出泵，能泵出癌細胞中的化療藥物。因基因療法具有較少的內(nèi)在毒性，所以我們認為特異性抑制P-糖蛋白表達是一種很好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的治療方法。目前，關(guān)于脫氧核酶逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性作用的研究很少。在這個課題中，我們合成了作用于翻譯起始密碼子AUG的硫代硫酸酯脫氧核酶，并轉(zhuǎn)染入具有MDR表型的乳腺癌細胞和白血病細胞中，同時也合成了

2、作用于相同基因區(qū)域的ASODN（反義寡核苷酸）和核糖酶，并與脫氧核酶做對比分析。
　　方法:
　　本實驗用RT-PCR，流式細胞術(shù)和Rh123滯留實驗檢測MDR1mRNA和P-糖蛋白的變量，用MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染細胞的化學(xué)敏感性。為了比較脫氧核酶與反義寡核苷酸及核糖酶逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用，我們將作用于翻譯起始密碼子的脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶分別轉(zhuǎn)染入藥物敏感細胞組MCF-7.K562及耐藥細胞組群MCF-7/ADM、K

3、562/ADR中，并與未轉(zhuǎn)染細胞，空白對照組及非特異性脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶做對比分析，通過檢測MDR1mRNA與P-糖蛋白變量及細胞內(nèi)Rh123滯留量評估脫氧核酶，反義寡核苷酸及核糖酶逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用及特異性。
　　結(jié)果:
　　1.在RT-PCR的分析中，MDR-1和β-actin的擴增量分別為396bp和206bp。細胞在分別轉(zhuǎn)染入脫氧核酶，反義寡糖甘酸，核糖酶與mock空白對照36小時后，在5ug/ml濃

4、度下，與未被處理的細胞組群相比較，轉(zhuǎn)染脫氧核酶，反義寡糖核酸和核糖酶細胞的MDR1mRNA的表達量顯著減少。沒有特殊處理的對照細胞組群沒有觀察到任何變化。在所有的細胞組群中GSTπmRNA的表達量均無變化。
　　2.在流式細胞術(shù)定量測定P糖蛋白表達量的實驗中，脫氧核酶能在0.5μg/ml的濃度下抑制P-糖蛋白的表達，它對P-糖蛋白的抑制作用出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后12小時，并在轉(zhuǎn)染后36小時達到峰值，并且脫氧核酶對P-糖蛋白的抑制作用好于核糖

5、酶質(zhì)粒和反義寡核苷酸。核糖酶質(zhì)粒對P-糖蛋白表達有較長時間的抑制作用。
　　3.我們用細胞內(nèi)Rh123滯留量實驗評估P糖蛋白的功能，結(jié)果顯示分別轉(zhuǎn)染脫氧核酶，反義寡核苷酸和核糖酶36小時后，在5μg/ml的濃度下，脫氧核酶組群細胞內(nèi)的Rh123滯留量顯著高于反義寡核苷酸和核糖酶細胞組群。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染后細胞中P-糖蛋白的泵出作用被抑制，尤其是在轉(zhuǎn)染脫氧核酶的細胞組群中。
　　4.在MTT藥物敏感性實驗中，我們觀察到與轉(zhuǎn)染