Twist基因下調(diào)對(duì)Caski細(xì)胞株化療敏感性改變的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Twist基因的shRNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株的建立
　　目的:
　　通過構(gòu)建Twist基因的pRNAT-U6.1/Neo/shRNA真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定低表達(dá)Twist基因的宮頸癌Caski細(xì)胞株，為探討Twist基因影響宮頸癌對(duì)紫杉醇的耐藥性及其機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.針對(duì)Twist基因構(gòu)建4組真核表達(dá)載體，并對(duì)重組載體進(jìn)行酶切鑒定和測序。
　　2.

2、經(jīng) Lipofectamine2000脂質(zhì)體將pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人宮頸癌 Caski細(xì)胞中，G418篩選，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染成功。
　　3.擴(kuò)大培養(yǎng)，從而建立穩(wěn)定細(xì)胞株Caski-Twist-shRNA。
　　4.應(yīng)用RT-PCR方法檢測穩(wěn)定細(xì)胞株Caski-Twist-s

3、hRNA中Twist mRNA的表達(dá)情況，鑒定干擾效果并篩選出轉(zhuǎn)染效率最佳的shRNA。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)雙酶切圖及測序檢測，成功構(gòu)建重組載體pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。
　　2.重組載體經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞，熒光顯微鏡顯示獲得穩(wěn)定單克隆細(xì)胞株Caski-Twist-shRNA。
　　3. RT-PCR方法鑒定其干擾效果，以Twist擴(kuò)增

4、產(chǎn)物(489bp)與內(nèi)參照β-actin(600bp)的比值來表示Twist mRNA的變化，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無顯著性（P>0.05)，轉(zhuǎn)染組1、轉(zhuǎn)染組2、轉(zhuǎn)染組3、轉(zhuǎn)染組4均與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)，表明成功建立穩(wěn)定干擾 Twist基因表達(dá)的Caski-Twist-shRNA細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染組2與轉(zhuǎn)染組1、轉(zhuǎn)染組3、轉(zhuǎn)染組4比較差異有顯著性(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染組2的轉(zhuǎn)染效率最佳。后續(xù)實(shí)驗(yàn)

5、應(yīng)用轉(zhuǎn)染組2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo-Twist-shRNA。
　　2.成功建立穩(wěn)定低表達(dá)Twist基因的Caski-Twist-shRNA細(xì)胞株。
　　第二部分 Twist基因下調(diào)對(duì)Caski細(xì)胞株化療敏感性改變的機(jī)制研究
　　目的：
　　探討Twist基因下調(diào)對(duì)Caski細(xì)胞株化療敏感性改變的機(jī)制研究。
　　方法：
　　1. MTT實(shí)

6、驗(yàn)分為三組：空白對(duì)照組（即未轉(zhuǎn)染組，Caski）、陰性對(duì)照組（即轉(zhuǎn)染 NC組，Caski-shRNA-NC）和實(shí)驗(yàn)組（Caski-Twist-shRNA2）。經(jīng)不同濃度（0.25、0.5、1、2、4μmol/L）紫杉醇處理48小時(shí)后，用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的OD值，并計(jì)算IC50值，篩選出紫杉醇最佳抑制濃度。
　　2. Western-blot實(shí)驗(yàn)分為四組：空白對(duì)照組(Caski)、正常對(duì)照組（Caski+Taxol）、陰性對(duì)

7、照組（Caski-shRNA-NC+Taxol）和實(shí)驗(yàn)組（Caski-Twist-shRNA2+Taxol）。經(jīng)Western-blot檢測四組細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白表達(dá)，分析下調(diào)Twist基因聯(lián)合紫杉醇處理后的Caski細(xì)胞中PI3K和AKT的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. MTT結(jié)果顯示：Twist基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）在不同紫杉醇濃度下的增殖抑制率與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比均顯著增加（P﹤0.05），實(shí)驗(yàn)

8、組IC50與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比明顯降低（P﹤0.05），紫杉醇最佳濃度為1000μmol/L。
　　2. Western-blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中PI3K的蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組、正常對(duì)照組和空白對(duì)照組均明顯降低(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)組中AKT的蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組、正常對(duì)照組和空白對(duì)照組均明顯降低(P均<0.05)，而陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組中PI3K和AKT的表達(dá)無明顯差異（P>0.05)。
　　結(jié)論：