LRP16對HeLa細胞的放化療敏感性的影響及其機制.pdf

1、DNA損傷是對于細胞穩(wěn)定性和基因完整性的主要威脅之一。細胞的損傷應答機制對于細胞的存活和防止腫瘤的形成非常重要。DNA損傷常涉及多種應答方式，包括有DNA損傷修復，細胞周期關卡，凋亡通路等。在各種 DNA損傷形式中，DNA雙鏈損傷(DNA double-strand breaks，DSB)最具細胞毒性作用，可由電離輻射(ionizing radiation，IR)、拓撲異構酶Ⅰ或Ⅱ的抑制劑，和代謝過程中形成的氧自由基等誘導發(fā)生。LRP1

2、6屬于Macro domain家族蛋白成員之一，研究證實它與多種腫瘤細胞的放化療抵抗有關。本室先前的結果證實內源性的LRP16與NF-κB的亞單位之一p65之間有相互作用，在 TNF-α存在條件下，抑制LRP16內源性表達，可以顯著抑制NF-κB的轉錄活性。
　　我們主要研究在電離輻射和依托泊苷(ETO)誘導條件下，LRP16對細胞的放化療抵抗的調控作用。
　　方法：首先，通過單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗檢測LRP16對于

3、DNA損傷的作用，進一步采用Western Blot檢測γH2Ax的表達水平來驗證LRP16對DNA損傷的作用。之后分別通過CCK-8法和AnnexinV標記與流式細胞計數(shù)的方法檢測了LRP16對細胞活力和凋亡的影響。最后通過RT-PCR法檢測NF-κB下游靶基因的轉錄水平。
　　結果：LRP16表達的增加下調了電離輻射和依托泊苷誘導的HeLa細胞損傷程度，抑制了DNA損傷修復；LRP16能夠抑制IR和ETO誘導的細胞毒性作用；在

4、抑制內源性LRP16的表達條件下，細胞的凋亡率顯著增加；但過表達LRP16時，存在細胞種類差異，并且對不同損傷誘導因子作用下，對其凋亡率的影響也存在差異。通過RNA干擾技術沉默HeLa細胞中內源性LRP16的表達可以降低NF-κB的轉錄活性，下調了其下游凋亡相關靶基因。
　　結論：本研究表明LRP16能增強腫瘤細胞對放化療的抵抗作用，這可能是通過調控NF-κB的轉錄活性來實現(xiàn)的。
　　第一部分 LRP16對HeLa細胞DNA

5、損傷的影響
　　目的：研究LRP16基因的表達與HeLa細胞的DNA損傷程度的相關性
　　方法：1.通過轉染質粒pCDNA3.1-LRP16實現(xiàn)LRP16的過表達，蛋白印跡實驗檢測蛋白表達水平；2.用單細胞凝膠電泳法(SCGE)，通過CASP軟件分析OTM值和tail length兩個指標；3.采用細胞流式技術檢測各組細胞中γH2AX表達量。
　　結果：1.蛋白印跡實驗結果示：轉染了pCDNA3.1-LRP16的HeL

6、a細胞LRP16的表達量與空質粒 pCDNA3.1相比明顯增高；2.采用圖像軟件CASP分析SCGE結果：分別用IR或ETO處理細胞后，LRP16過表達組與空質粒相比，OTM值和tail length兩個指標的值有統(tǒng)計學差異(p<0.05)3.流式細胞檢測結果：分別用IR或ETO處理細胞后，LRP16過表達組與空質粒相比，超過預設熒光強度值的細胞數(shù)占總細胞數(shù)百分比差異顯著(P<0.05)。
　　結論：外源性增加LRP16的表達量能

7、夠抑制電離輻射和依托泊苷誘導的DNA損傷，其機制是抑制了H2AX的磷酸化過程。
　　第二部分 LRP16對HeLa細胞的放化療敏感性的影響
　　目的：探討LRP16對電離輻射或依托泊苷誘導的腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。
　　方法：1.將抑制LRP16表達的小干擾RNA，control siRNA，siRNA-374，siRNA-668，分別轉染入HeLa，H1299，MCF-7細胞內，并通過電離輻射或依托泊苷處理的細胞；

8、用CCK-8檢測細胞活力；用DAPI染色和流式細胞技術測定抑制LRP16的表達對HeLa細胞的凋亡率的影響；2.將轉染了質粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-LRP16的分別轉染入HeLa，H1299，MCF-7細胞內，并通過電離輻射或依托泊苷處理的細胞；用CCK-8檢測細胞活力；用流式細胞技術測定LRP16的表達對HeLa細胞的凋亡率的影響。3.通過RT-PCR檢測抑制LRPl6表達之后核轉錄因子-κB(nuclearfactor-

9、κB，NF-κB)凋亡相關的下游靶基因的mRNA水平。
　　結果：在依托泊苷或者電離輻射的作用下，通過siRNA轉染抑制LRP16的表達使能夠明顯抑制HeLa細胞的增殖(p<0.05)。同時增加細胞的凋亡率(p<0.05)；然而，在過表達組，LRP16對HeLa，H1299，MCF-7細胞的凋亡率的影響并不一致。在HeLa和MCF-7細胞中，LRP16對凋亡無影響(p>0.05)；在H1299細胞中，LRP16的表達的上調促進了細