RIP3對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、死亡和化療敏感性的作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最為常見(jiàn)，惡性程度最高的膠質(zhì)瘤類型。同其他腫瘤一樣，GBM的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)各種輔助治療方式的抵抗與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多基因的調(diào)節(jié)及多種因素相互作用有關(guān)。基因治療被認(rèn)為是各種惡性腫瘤非常有前景的治療方式，慢病毒載體介導(dǎo)的基因治療因其較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，較好的操控性，既可感染分裂期也可感染非分裂期細(xì)胞，并可將外源基因整合入目的細(xì)胞基因組中，長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)

2、外源基因，是基因治療中非常有力的工具；慢病毒載體還可介導(dǎo)RNA干擾，從而持續(xù)穩(wěn)定地抑制靶基因的表達(dá)。凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，并且已得到了非常廣泛而深入地研究。一般認(rèn)為壞死是一個(gè)不可調(diào)控的、非程序性的細(xì)胞死亡方式，然而，研究證實(shí)，壞死可能至少部分是通過(guò)程序調(diào)控而形成的，這種細(xì)胞死亡被命名為稗序件壞死。RIP3，屬于RIP家族成員，是Ser/Thr蛋白激酶，因其結(jié)構(gòu)中含有RIP家族同源激酶結(jié)構(gòu)域而得名。RIP3在人體多個(gè)正常組織中有表達(dá)，

3、而在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中卻表達(dá)下降或缺失，研究發(fā)現(xiàn)，RIP3是程序性細(xì)胞壞死過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。GBM的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)放化療的抵抗與腫瘤細(xì)胞凋亡功能失調(diào)有重要的關(guān)系。雖然凋亡過(guò)程有缺陷，幾乎所有的GBM均表現(xiàn)出不同程度的瘤內(nèi)壞死。另外，某些抗腫瘤的輔助治療方式通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤壞死對(duì)多種惡性腫瘤產(chǎn)生良好的治療效應(yīng)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死從而清除腫瘤細(xì)胞在近年來(lái)逐漸得到重視。然而，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死來(lái)治療惡性腫瘤的研究鮮有報(bào)道，且尚未有壞死關(guān)鍵因子

4、RIP3對(duì)惡性膠質(zhì)瘤作用的研究。我們通過(guò)構(gòu)建重組人RIP3慢病毒過(guò)表達(dá)載體和慢病毒shRNA干擾載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)GBM細(xì)胞株U251，調(diào)控RIP3基因在GBM細(xì)胞中的表達(dá)，研究RIP3對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、死亡的影響及對(duì)臨床標(biāo)準(zhǔn)的惡性膠質(zhì)瘤化療藥替莫唑胺敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制，為RIP3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.使用Gateway技術(shù)構(gòu)建人RIP3慢病毒過(guò)表達(dá)載體。使用酶切連接技術(shù)構(gòu)

5、建RIP3慢病毒干擾載體。
　　 2.攜帶人RIP3基因的重組HIV-1慢病毒與攜帶RIP3 shRNA序列的慢病毒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型U251(U251-WT)細(xì)胞株，通過(guò)G418篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)后的U251，Western blot鑒定RIP3的表達(dá)情況。
　　 3.使用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)U251-WT細(xì)胞、U251-RIP3細(xì)胞，U251-shRIP3細(xì)胞的死亡情況，進(jìn)一步使用廣譜Caspase抑制劑zVAD驗(yàn)證

6、死亡方式。
　　 4.使用CellROXTM Deep Red試劑檢測(cè)U251-WT細(xì)胞、U251-RIP3細(xì)胞，U251-shRIP3細(xì)胞中ROS的表達(dá)水平，研究ROS在RIP3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。
　　 5.ELISA法檢測(cè)上述U251-WT細(xì)胞、U251-RIP3細(xì)胞，U251-shRIP3細(xì)胞中的TNF-α的分泌情況，研究其在RIP3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。
　　 6.MTT檢測(cè)上述U251-WT細(xì)胞

7、、U251-RIP3細(xì)胞，U251-shRIP3細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　 7.Western blot法檢測(cè)上述三株細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵因子Akt的磷酸化情況。
　　 8.MTT法檢測(cè)上述三株細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性差異。使用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)U251-WT細(xì)胞、U251-RIP3細(xì)胞在temozolomide作用下的死亡情況。
　　 9.Western blot法檢測(cè)U251-WT，U

8、251-RIP3，U251-shRIP3中PARP-1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建RIP3慢病毒過(guò)表達(dá)載體和慢病毒shRNA干擾載體，并與第四代包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，獲得高達(dá)3×108 TU/ml的病毒顆粒。
　　 2.攜帶人RIP3基因的慢病毒與攜帶RIP3 shRNA序列的慢病毒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)U251-WT細(xì)胞株，通過(guò)G418篩選，分別獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人RIP3基因和RIP3被干擾的細(xì)胞株(U25

9、1-RIP3及U251-shRIP3)。
　　 3.過(guò)表達(dá)RIP3的U251細(xì)胞出現(xiàn)腫脹樣死亡，且這種死亡不被廣譜的caspase抑制劑阻斷，Annexin V/PI檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)為死亡細(xì)胞PI強(qiáng)陽(yáng)性。過(guò)表達(dá)RIP3的U251細(xì)胞死亡率明顯高于U251-WT及U251-shRIP3，且RIP3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)U251細(xì)胞死亡需要依賴ROS的產(chǎn)生，使用ROS清除劑BHA作用后，其死亡明顯減少。
　　 4.與野生型相比，過(guò)表達(dá)RI

10、P3的U251細(xì)胞TNF-α分泌明顯增加。而U251-WT與U251-shRIP3的 TNF-α分泌無(wú)明顯差別。
　　 5.在替莫唑胺(TMZ)作用下，過(guò)表達(dá)RIP3的U251細(xì)胞增殖能力明顯低于U251-shRIP3和U251-WT細(xì)胞。且U251-RIP3的細(xì)胞死亡率明顯高于U1251-WT細(xì)胞。
　　 6.相比U251-WT和U251-shRIP3細(xì)胞，過(guò)表達(dá)RIP3的U251細(xì)胞株對(duì) TMZ作用的敏感性增加，這種

11、作用與RIP3影響PARP-1的表達(dá)有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.RIP3可誘導(dǎo) U251出現(xiàn)壞死。RIP3誘導(dǎo)U251細(xì)胞 TNF-α分泌增加，進(jìn)一步增加ROS產(chǎn)生從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。RIP3通過(guò)抑制P13K/Akt信號(hào)通路而影響U251的增殖、生長(zhǎng)。RIP3是GBM基因治療的一個(gè)新的的靶分子。
　　 2.RIP3通過(guò)影響PARP-1的表達(dá)調(diào)控U251對(duì) TMZ的敏感性，RIP3是一種新的調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物敏