EZH2參與調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對替莫唑胺化療敏感性的機(jī)理研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，約2/3為惡性膠質(zhì)瘤。盡管目前常規(guī)手術(shù)、放療和化療等綜合措施取得了長足進(jìn)步，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的2年生存率仍不到30％。臨床上常出現(xiàn)相同級別和相同治療方案的腦膠質(zhì)瘤患者存在明顯預(yù)后不同的現(xiàn)象，究其原因可能與腫瘤內(nèi)在的生物特性以及對化療的敏感性密切相關(guān)。近年來腦膠質(zhì)瘤的化療逐步得到重視，TMZ已成為輔助化療中的一線藥物，因此影響化療敏感性以及探討其機(jī)理也成為臨床神經(jīng)外科十分關(guān)注的課題之一。

2、>　　果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2即EZH2作為PRC2的催化亞基，它可以在組蛋白3上的27位賴氨酸上添加3個甲基基團(tuán)。這種3甲基化后的組蛋白可以導(dǎo)致染色質(zhì)凝集和很多與腫瘤增殖、侵襲性以及血管生成等方面有關(guān)的癌基因或抑癌基因在表觀遺傳學(xué)上的激活或沉默。
　　本研究擬體外在U87、U251、T98三個膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中分析EZH2的表達(dá)差異，構(gòu)建EZH2慢病毒干擾的GBM轉(zhuǎn)染株，建立EZH2表達(dá)量不同的GBM細(xì)胞株，然后檢測其

3、對替莫唑胺的敏感性的變化，同時進(jìn)一步測定EZH2的表達(dá)水平與DNA損傷修復(fù)蛋白表達(dá)量的關(guān)系，并通過抑制DNA損傷修復(fù)通路中的關(guān)鍵蛋白來檢測GBM對替莫唑胺的敏感性變化，從而探討DNA損傷修復(fù)途徑在EZH2調(diào)控GBM對化療耐藥中的作用。實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分，研究EZH2表達(dá)水平與GBM對TMZ化療敏感性的關(guān)系;第二部分，DNA修復(fù)在EZH2調(diào)控GBM對TMZ敏感性中的作用
　　第一部分 EZH2表達(dá)水平與GBM對TMZ化療敏感性

4、強(qiáng)弱的關(guān)系
　　目的:研究EZH2與膠質(zhì)瘤化療敏感性之間的關(guān)系，驗(yàn)證EZH2敲減后的GBM細(xì)胞株對TMZ化療敏感性的變化。
　　方法:分別應(yīng)用Real-time PCR和Westem-blot方法檢測EZH2在U87、U251、T98中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并應(yīng)用CCK-8法檢測U87、U251、T98對TMZ的IC50值的不同。構(gòu)建EZH2干擾的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染GBM細(xì)胞株，用流式細(xì)胞學(xué)鑒定轉(zhuǎn)染率，RT-PCR和Wes

5、tern-blot方法鑒定EZH2的mRNA和蛋白的敲減效率，并用CCK-8法檢測敲減EZH2后的細(xì)胞株對TMZ敏感性的變化。
　　結(jié)果:EZH2的mRNA表達(dá)水平依次為U251＞T98＞U87，U251與T98之間未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，U87分別與U251和T98兩兩之間達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EZH2的蛋白表達(dá)水平與其mRNA表達(dá)水平高低順序基本相同。U251、T98和U87經(jīng)替莫唑胺處理后測得其IC50值依次降低，U251與T98之間無

6、明顯差異，U87與U251之間有顯著差異，U87與T98之間有顯著差異。慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞U87、U251細(xì)胞株后的轉(zhuǎn)染率經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測得均達(dá)99％以上，其相應(yīng)的EZH2蛋白敲減效率分別達(dá)95％和50％。在U87、U251中，敲減EZH2的細(xì)胞株對TMZ的IC50值相較于未敲減株明顯降低。
　　結(jié)論:EZH2的高表達(dá)使GBM細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性減弱，敲減EZH2后，U87和U251細(xì)胞對TMZ的敏感性均明顯增強(qiáng)。
　　第二部分

7、 DNA修復(fù)途徑在EZH2調(diào)控的GBM對TMZ敏感性中的作用
　　目的:研究EZH2基因敲減后的DNA修復(fù)水平變化及與GBM對TMZ敏感性變化的關(guān)系。
　　方法:建立EZH2敲減的U87、U251細(xì)胞株，通過western-blot檢測其MGMT、MSH2、MSH6、XRCC1、PARP1蛋白表達(dá)水平的變化，并通過抑制PARP1后用CCK-8法檢測U87、U251(si-EZH2)細(xì)胞株對TMZ的IC50值變化。
　　

8、結(jié)果:敲減EZH2的U87細(xì)胞株的XRCC1、MSH2、MSH6、PARP1蛋白表達(dá)水平較未敲減組明顯降低。而敲減EZH2的U251細(xì)胞株MGMT、PARP1蛋白表達(dá)水平較未敲減組明顯降低。U87和U251細(xì)胞株的si-EZH2+PARP1 i組的IC50值均較si-EZH2組明顯降低，PARP1 i組較正常對照組IC50值明顯降低，但其與si-EZH2組比較未見明顯變化。經(jīng)TMZ誘導(dǎo)后U87、U251的PARP1蛋白水平隨著加藥時間的

9、延長有所上升且未敲減EZH2組的PARP1蛋白水平較敲減組上升的更為明顯。
　　研究結(jié)果說明:DNA修復(fù)蛋白PARP1受抑制后，U87、U251細(xì)胞對TMZ的敏感性明顯增加;同時敲減EZH2和抑制PARP1后的U87、U251對TMZ敏感性增加最明顯，且隨著TMZ誘導(dǎo)時間的延長，未敲減組的PARP1蛋白水平較敲減組有明顯的增加。
　　結(jié)論:EZH2蛋白表達(dá)水平可影響相關(guān)DNA修復(fù)蛋白表達(dá)水平，提示EZH2基因可能參與了DNA