Dec1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對烷化劑替莫唑胺化療敏感性的影響.pdf

1、Dec1(human differentially expressed in chondrocytes)也被稱為Stra13(stimulated with retinoic acid),BHLBH2(basic helix-loop-helix binding protein 2)或Sharp2(split and hairy related protein)是由Shen等在對哺乳動物分化系統(tǒng)的研究中從人類軟骨細(xì)胞中分離得到的一個bH

2、LH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。該轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝、甚至?xí)円构?jié)律中均發(fā)揮重要作用。近期,越來越多的研究表明Dec1在一系列的腫瘤中均存在高表達(dá),并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。例如,Dec1的表達(dá)在正常乳腺向原位及浸潤型癌的發(fā)展過程中顯著增加,并且與乳腺癌惡性級別呈正相關(guān)。Zheng等發(fā)現(xiàn)Dec1的表達(dá)在高分化向中度分化和低分化胃癌組織惡性進(jìn)展的過程中顯著上調(diào)。另外,與相鄰正常組織相比,Stra13基因在結(jié)腸癌中大量表達(dá)。

3、腎癌中,Stra13可以作為pVHL的靶點,由pVHL介導(dǎo)的表達(dá)下調(diào)說明其在腎癌腫瘤發(fā)生中的重要作用。在非小細(xì)胞肺癌中,Dec1的過表達(dá)與HIF-1α及碳酸酐酶-9密切相關(guān)。所有證據(jù)均表明Dec1在腫瘤惡性進(jìn)展中的重要作用。然而在人腦膠質(zhì)瘤中,Dec1的表達(dá)情況或其預(yù)后與治療意義卻未見明確報道。
　　本研究中,我們主要通過免疫組化的方法檢測人腦膠質(zhì)瘤樣本Dec1的表達(dá)情況,并且進(jìn)一步分析Dec1的表達(dá)與患者臨床病理資料、預(yù)后、替莫

4、唑胺化療反應(yīng)性和替莫唑胺誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性。另外,我們成功的構(gòu)建了Dec1慢病毒表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)Dec1的U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株,并在體內(nèi)明確了Dec1過表達(dá)對膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療反應(yīng)性的影響。
　　1.Dec1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對替莫唑胺化療敏感性的影響
　　目的:Dec1是調(diào)控細(xì)胞分化和凋亡抑制的關(guān)鍵基因,在人類許多腫瘤中均存在高表達(dá)并且與腫瘤的惡性進(jìn)展關(guān)系緊密。由于分化不良和低程度凋亡與腫瘤患者

5、的預(yù)后不良和放/化療耐受密切相關(guān),我們對Dec1表達(dá)的預(yù)后價值進(jìn)行評估,并且進(jìn)一步分析其表達(dá)情況對膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者替莫唑胺化療反應(yīng)性的影響。
　　方法:通過免疫組化的方法,在157例新診斷的原發(fā)性膠質(zhì)細(xì)胞瘤和在替莫唑胺化療期間復(fù)發(fā)的63例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,對Dec1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。在新診斷的原發(fā)性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中,分析Dec1表達(dá)情況與患者的臨床病理資料、預(yù)后和替莫唑胺化療敏感性之間的相關(guān)性。在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,通過

6、TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法分析Dec1的表達(dá)情況與凋亡指數(shù)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:Dec1高表達(dá)與腫瘤高水平的病理級別和替莫唑胺化療較差的反應(yīng)性顯著相關(guān),并且可以作為一項獨立的危險因素提示新診斷的原發(fā)性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的預(yù)后不良。在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,Dec1的表達(dá)與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:在膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中,Dec1無論是作為臨床預(yù)后因子或是對替莫唑胺化療反應(yīng)性的預(yù)測因子,都具有非常重要的價值。
　

7、　2.基于GatewayTM系統(tǒng)Dec1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的:利用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建Dec1基因的慢病毒表達(dá)載體并建立穩(wěn)定表達(dá)該目的基因的人腦膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞株。
　　方法:從人腦膠質(zhì)瘤組織中提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到目的cDNA。設(shè)計含有特異性酶切位點的引物,通過PCR擴(kuò)增,獲得用于重組的Dec1目的基因全長。將目的片段克隆至入門載體pENTRTM3C中產(chǎn)生入門克隆。利用GatewayTM技術(shù),

8、將入門克隆中的目的片段轉(zhuǎn)接于目的載體Plenti6.3中產(chǎn)生表達(dá)克隆pLenti6.3-Dec1。在293T細(xì)胞中包裝慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-Dec1并轉(zhuǎn)染U251和U87細(xì)胞,通過Blasticidin篩選、Western blot鑒定,得到穩(wěn)定表達(dá)Dec1的U251和U87細(xì)胞株。
　　結(jié)果:目的基因Dec1全長的獲取與慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-Dec1的構(gòu)建經(jīng)PCR和測序得到證實。用pLenti6.3-De

9、c1轉(zhuǎn)染U251和U87細(xì)胞后,通過Blasticidin篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)Dec1的U251和U87細(xì)胞株。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了pLenti6.3-Dec1慢病毒表達(dá)載體并建立穩(wěn)定表達(dá)Dec1的人腦膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞株,為深入研究Dec1分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　3.Dec1過表達(dá)在體內(nèi)對膠質(zhì)細(xì)胞瘤替莫唑胺化療敏感性的影響
　　目的:建立U87-cherry(對照)和U87-Dec1膠質(zhì)瘤細(xì)胞的裸鼠成瘤模型。

10、經(jīng)替莫唑胺處理后,觀察Dec1過表達(dá)對移植瘤替莫唑胺化療敏感性的影響。
　　方法:將1×106個U87-cherry和U87-Dec1腫瘤細(xì)胞分別皮下注射至每只裸鼠腹側(cè)形成移植瘤。接種5-7天形成可觸及的腫瘤后,連續(xù)5天在裸鼠飲食中添加50mg/kg的替莫唑胺。按照以下公式記錄腫瘤體積:體積=a×b2/2(a=最長徑,b=最短徑)。取出皮下腫瘤進(jìn)行稱重后,制備病理切片標(biāo)本,通過增殖標(biāo)記Ki-67的免疫染色及TdT介導(dǎo)dUTP缺口末

11、端標(biāo)記法分別檢測移植瘤的增殖和凋亡情況。
　　結(jié)果:經(jīng)過替莫唑胺處理30天后,U87-Dec1組移植瘤的平均重量和體積(114±12.99mg,1257±382.7mm3)顯著高于U87-cherry組(44±2.63mg,468.8±193.4mm3,兩者P<0.001)。增殖及凋亡檢測結(jié)果表明,U87-Dec1組移植瘤腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)(51.6±3.74％)顯著高于U87-cherry組(38.20±3.55%,t=2.60