人腦膠質瘤中DEC1的表達對烷化劑替莫唑胺化療敏感性影響的分子機制.pdf

1、神經(jīng)膠質瘤是人腦最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的半數(shù)以上，并且預后極差。其中，多形性膠質母細胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM，WHO IV級）具有低度分化，高度惡性，對放化療易發(fā)生耐受等特點。癌基因胚胎軟骨發(fā)育基因1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene1，DEC1)的轉錄調(diào)控功能對腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展至關重要。該分子的高度表達存在于人類多種惡

2、性腫瘤之中，并且預示腫瘤細胞的惡性分化程度。我們前期研究發(fā)現(xiàn) DEC1在膠質瘤中的表達與膠質瘤的病理級別呈顯著的相關性，不但可以作為獨立的預后因素，而且能夠預示高級別膠質瘤患者對烷化劑替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）化療的反應性。然而，DEC1的表達對替莫唑胺細胞毒性影響的具體分子機制卻不明確。
　　核微球蛋白58（The nucleolar58-kD microspherule protein，MSP58）是DEC1

3、的相互作用分子，該分子同樣在人類多種腫瘤中存在高表達，是一個癌基因。DEC1發(fā)揮多種生物學功能都是通過與MSP58的相互作用而實現(xiàn)的。MLH1（Mut L homolog1，M u t L同源基因）是DNA錯配修復系統(tǒng)（Mis-match repair，MMR）的重要調(diào)控因子，該分子的表達缺失或功能缺陷能夠導致腫瘤細胞對烷化劑細胞毒性產(chǎn)生耐受。轉錄調(diào)控因子DEC1能夠結合MLH1啟動子區(qū)域的E-box序列從而抑制MLH1的表達。MSP5

4、8和MLH1作為與DEC1癌基因功能密切相關的蛋白分子，能否成為DEC1影響TMZ化療敏感性的關鍵所在，為本課題的主要研究內(nèi)容。
　　第一部分人腦膠質瘤中MSP58的表達及其對替莫唑胺化療敏感性的影響
　　目的：
　　本課題前期研究首次明確了MSP58在人腦膠質瘤中的癌基因作用，并且發(fā)現(xiàn)DEC1的表達對膠質瘤患者替莫唑胺化療反應性具有重要影響。然而， MSP58能否作為膠質瘤患者的預后因素卻未見明確報道，并且作為與 D

5、EC1癌基因功能密切相關的相互作用分子，MSP58的表達情況對膠質瘤患者替莫唑胺化療反應性的影響也未知。
　　方法：
　　我們主要利用免疫組化的方法，在158例原發(fā)性膠質瘤樣本和63例接受術后TMZ化療、且腫瘤復發(fā)的復發(fā)性GBM樣本中，檢測MSP58的表達情況，并且進一步與患者臨床病理資料、預后、替莫唑胺化療反應性等方面做相關性分析。腫瘤細胞增殖能力應用核增殖抗原Ki-67的免疫組化染色進行評估，并在MSP58不同表達水平之

6、間進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　MSP58的表達水平與原發(fā)性膠質瘤患者WHO級別（P＜0.001）和KPS評分（P=0.003）均顯著相關。生存分析表明，MSP58的表達水平越高、患者預后越差（P＜0.001）。多因素Cox回歸模型結果顯示，MSP58的表達水平可以作為原發(fā)性膠質瘤患者獨立的預后因素。另外，隨MSP58表達水平的不斷增高，膠質瘤細胞的增殖能力也在不斷的增強（P＜0.01）。然而，在復發(fā)性 GBM中，MSP

7、58的表達情況與TMZ化療反應性之間并沒有表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　MSP58的表達水平與膠質瘤患者的WHO級別和增殖能力具有顯著的相關性，說明MSP58在神經(jīng)膠質細胞瘤腫瘤的發(fā)生和惡性進展中能夠發(fā)揮重要的作用。然而，MSP58的表達水平在原發(fā)性和復發(fā)性膠質瘤患者中未見顯著差異，說明TMZ化療對膠質瘤患者MSP58的表達水平并無明確的影響。另外，MSP58的表達與復發(fā)性膠質瘤患者 TMZ化療反應性之間并未表現(xiàn)

8、出顯著的統(tǒng)計學相關性，說明 DEC1影響TMZ細胞毒性的具體分子機制可能并非是通過與MSP58的相互作用而實現(xiàn)的。更重要的是，MSP58表達水平與膠質瘤患者總生存時間顯著相關，說明MSP58能夠作為一個輔助 WHO分級系統(tǒng)的新型的預后標志，并且這一癌基因很有可能成為神經(jīng)膠質細胞瘤患者靶向治療的重要靶點。
　　第二部分人腦膠質瘤中DEC1的表達對替莫唑胺化療敏感性影響的分子機制
　　目的：
　　本課題前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) D

9、EC1的表達對膠質瘤患者替莫唑胺化療反應性具有重要影響。MMR是DNA損傷修復、調(diào)控烷化劑化療耐受最主要的機制。MLH1作為MMR系統(tǒng)的關鍵分子，其突變或缺失的細胞系對TMZ均具有抵抗性；然而，作為MLH1的轉錄調(diào)控因子，DEC1能否通過抑制MLH1的表達水平從而影響TMZ發(fā)揮細胞毒性卻有待驗證。
　　方法：
　　首先，在63例接受術后TMZ化療、且腫瘤復發(fā)的復發(fā)性GBM樣本中，我們利用免疫組化的方法檢測DEC1和MLH1的

10、表達情況；利用TdT介導dUTP缺口末端標記法（TUNEL）評估腫瘤細胞的凋亡情況。然后，以人腦膠質瘤 U251和U87細胞為研究對象，通過構建 DEC1特異性干涉片段慢病毒表達載體的方法，進一步的建立穩(wěn)定表達DEC1-shRNA的膠質瘤細胞系。最后，在DEC1不同表達背景的膠質瘤細胞中分析TMZ細胞毒性的表現(xiàn)差異，并且檢測相關蛋白分子的表達水平，以明確DEC1對TMZ化療反應性影響的具體分子機制。
　　結果：
　　復發(fā)性G

11、BM標本中DEC1與MLH1的表達水平之間呈負相關（r=-0.55， P<0.001），并且GBM腫瘤細胞的凋亡率隨MLH1的表達水平的增加而升高（r=0.29， P＜0.001）。另外，對DEC1特異性干涉片段的測序鑒定結果表明成功的構建了慢病毒表達載體 psi-LV-DEC1-shRNA，并且熒光顯微鏡下證實獲得了穩(wěn)定表達DEC1-shRNA的膠質瘤細胞株U251/U87-DEC1-shRNA。細胞毒性分析結果表明，膠質瘤細胞DEC

12、1的表達被干涉后，MLH1的表達顯著上調(diào)，腫瘤細胞對TMZ的敏感性顯著增加；相反，在DEC1過表達的情況下，膠質瘤細胞MLH1的表達受到了明顯的抑制，并且對TMZ的敏感性顯著下降。
　　結論：
　　MLH1的表達水平與復發(fā)性GBM患者TMZ的化療耐受性密切相關。作為MLH1的轉錄調(diào)控基因，DEC1影響GBM患者TMZ化療反應性的分子機制正是通過對MLH1的轉錄調(diào)控而實現(xiàn)的。這些結論不但揭示了DEC1在TMZ化療耐受過程中發(fā)揮