人腦膠質(zhì)瘤中DEC1的表達(dá)對(duì)烷化劑替莫唑胺化療敏感性影響的分子機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人腦最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的半數(shù)以上，并且預(yù)后極差。其中，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM，WHO IV級(jí)）具有低度分化，高度惡性，對(duì)放化療易發(fā)生耐受等特點(diǎn)。癌基因胚胎軟骨發(fā)育基因1(Differentiated embryo chondrocyte expressed gene1，DEC1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。該分子的高度表達(dá)存在于人類多種惡

2、性腫瘤之中，并且預(yù)示腫瘤細(xì)胞的惡性分化程度。我們前期研究發(fā)現(xiàn) DEC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別呈顯著的相關(guān)性，不但可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素，而且能夠預(yù)示高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者對(duì)烷化劑替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）化療的反應(yīng)性。然而，DEC1的表達(dá)對(duì)替莫唑胺細(xì)胞毒性影響的具體分子機(jī)制卻不明確。
　　核微球蛋白58（The nucleolar58-kD microspherule protein，MSP58）是DEC1

3、的相互作用分子，該分子同樣在人類多種腫瘤中存在高表達(dá)，是一個(gè)癌基因。DEC1發(fā)揮多種生物學(xué)功能都是通過與MSP58的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。MLH1（Mut L homolog1，M u t L同源基因）是DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（Mis-match repair，MMR）的重要調(diào)控因子，該分子的表達(dá)缺失或功能缺陷能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑細(xì)胞毒性產(chǎn)生耐受。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DEC1能夠結(jié)合MLH1啟動(dòng)子區(qū)域的E-box序列從而抑制MLH1的表達(dá)。MSP5

4、8和MLH1作為與DEC1癌基因功能密切相關(guān)的蛋白分子，能否成為DEC1影響TMZ化療敏感性的關(guān)鍵所在，為本課題的主要研究內(nèi)容。
　　第一部分人腦膠質(zhì)瘤中MSP58的表達(dá)及其對(duì)替莫唑胺化療敏感性的影響
　　目的：
　　本課題前期研究首次明確了MSP58在人腦膠質(zhì)瘤中的癌基因作用，并且發(fā)現(xiàn)DEC1的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療反應(yīng)性具有重要影響。然而， MSP58能否作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后因素卻未見明確報(bào)道，并且作為與 D

5、EC1癌基因功能密切相關(guān)的相互作用分子，MSP58的表達(dá)情況對(duì)膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療反應(yīng)性的影響也未知。
　　方法：
　　我們主要利用免疫組化的方法，在158例原發(fā)性膠質(zhì)瘤樣本和63例接受術(shù)后TMZ化療、且腫瘤復(fù)發(fā)的復(fù)發(fā)性GBM樣本中，檢測MSP58的表達(dá)情況，并且進(jìn)一步與患者臨床病理資料、預(yù)后、替莫唑胺化療反應(yīng)性等方面做相關(guān)性分析。腫瘤細(xì)胞增殖能力應(yīng)用核增殖抗原Ki-67的免疫組化染色進(jìn)行評(píng)估，并在MSP58不同表達(dá)水平之

6、間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　MSP58的表達(dá)水平與原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者WHO級(jí)別（P＜0.001）和KPS評(píng)分（P=0.003）均顯著相關(guān)。生存分析表明，MSP58的表達(dá)水平越高、患者預(yù)后越差（P＜0.001）。多因素Cox回歸模型結(jié)果顯示，MSP58的表達(dá)水平可以作為原發(fā)性膠質(zhì)瘤患者獨(dú)立的預(yù)后因素。另外，隨MSP58表達(dá)水平的不斷增高，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力也在不斷的增強(qiáng)（P＜0.01）。然而，在復(fù)發(fā)性 GBM中，MSP

7、58的表達(dá)情況與TMZ化療反應(yīng)性之間并沒有表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　MSP58的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的WHO級(jí)別和增殖能力具有顯著的相關(guān)性，說明MSP58在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展中能夠發(fā)揮重要的作用。然而，MSP58的表達(dá)水平在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者中未見顯著差異，說明TMZ化療對(duì)膠質(zhì)瘤患者M(jìn)SP58的表達(dá)水平并無明確的影響。另外，MSP58的表達(dá)與復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤患者 TMZ化療反應(yīng)性之間并未表現(xiàn)

8、出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，說明 DEC1影響TMZ細(xì)胞毒性的具體分子機(jī)制可能并非是通過與MSP58的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。更重要的是，MSP58表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者總生存時(shí)間顯著相關(guān)，說明MSP58能夠作為一個(gè)輔助 WHO分級(jí)系統(tǒng)的新型的預(yù)后標(biāo)志，并且這一癌基因很有可能成為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者靶向治療的重要靶點(diǎn)。
　　第二部分人腦膠質(zhì)瘤中DEC1的表達(dá)對(duì)替莫唑胺化療敏感性影響的分子機(jī)制
　　目的：
　　本課題前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) D

9、EC1的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療反應(yīng)性具有重要影響。MMR是DNA損傷修復(fù)、調(diào)控烷化劑化療耐受最主要的機(jī)制。MLH1作為MMR系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，其突變或缺失的細(xì)胞系對(duì)TMZ均具有抵抗性；然而，作為MLH1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，DEC1能否通過抑制MLH1的表達(dá)水平從而影響TMZ發(fā)揮細(xì)胞毒性卻有待驗(yàn)證。
　　方法：
　　首先，在63例接受術(shù)后TMZ化療、且腫瘤復(fù)發(fā)的復(fù)發(fā)性GBM樣本中，我們利用免疫組化的方法檢測DEC1和MLH1的

10、表達(dá)情況；利用TdT介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）評(píng)估腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。然后，以人腦膠質(zhì)瘤 U251和U87細(xì)胞為研究對(duì)象，通過構(gòu)建 DEC1特異性干涉片段慢病毒表達(dá)載體的方法，進(jìn)一步的建立穩(wěn)定表達(dá)DEC1-shRNA的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。最后，在DEC1不同表達(dá)背景的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分析TMZ細(xì)胞毒性的表現(xiàn)差異，并且檢測相關(guān)蛋白分子的表達(dá)水平，以明確DEC1對(duì)TMZ化療反應(yīng)性影響的具體分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　復(fù)發(fā)性G

11、BM標(biāo)本中DEC1與MLH1的表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.55， P<0.001），并且GBM腫瘤細(xì)胞的凋亡率隨MLH1的表達(dá)水平的增加而升高（r=0.29， P＜0.001）。另外，對(duì)DEC1特異性干涉片段的測序鑒定結(jié)果表明成功的構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體 psi-LV-DEC1-shRNA，并且熒光顯微鏡下證實(shí)獲得了穩(wěn)定表達(dá)DEC1-shRNA的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251/U87-DEC1-shRNA。細(xì)胞毒性分析結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞DEC

12、1的表達(dá)被干涉后，MLH1的表達(dá)顯著上調(diào)，腫瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性顯著增加；相反，在DEC1過表達(dá)的情況下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞MLH1的表達(dá)受到了明顯的抑制，并且對(duì)TMZ的敏感性顯著下降。
　　結(jié)論：
　　MLH1的表達(dá)水平與復(fù)發(fā)性GBM患者TMZ的化療耐受性密切相關(guān)。作為MLH1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，DEC1影響GBM患者TMZ化療反應(yīng)性的分子機(jī)制正是通過對(duì)MLH1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)論不但揭示了DEC1在TMZ化療耐受過程中發(fā)揮