低氧激活非折疊蛋白反應(yīng)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的作用及機(jī)制.pdf

1、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是人體常見的惡性腫瘤，在發(fā)展中國家是第三大最常見的腫瘤，在全球排名第六。由于HNSCC發(fā)病部位較隱蔽，且多呈浸潤性生長，粘膜下易擴(kuò)散，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差。迄今為止，針對(duì)晚期頭頸鱗癌的主要治療方案是以手術(shù)為主，配以放化療為主的綜合治療。盡管過去的20-30年里在HNSCC的診斷和治療方面有了一定的改進(jìn)，但患者的5年存活率卻無明

2、顯改善。頭頸鱗癌對(duì)放化療敏感性較低，難以控制的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后較差的主要原因。因此，重估當(dāng)前對(duì)HNSCC的認(rèn)識(shí)，深入研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理及尋求新的有效治療策略是至關(guān)重要的。
　　 目前大量研究表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的治療抵抗與其生長的微環(huán)境密不可分。腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞生長速度快，耗氧量增加，并且腫瘤內(nèi)部血管分布雜亂無章，血供相對(duì)不足，造成實(shí)體腫瘤內(nèi)部微環(huán)境低氧。低氧可造成腫瘤細(xì)胞生長周期阻滯、藥物彌散障礙、基因轉(zhuǎn)錄

3、活性及其表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生變化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存、侵襲及轉(zhuǎn)移，造成對(duì)放化療的抗性增強(qiáng)。研究表明，低氧是頭頸鱗癌不良預(yù)后的最關(guān)鍵因素。因此靶向腫瘤微環(huán)境低氧，將對(duì)頭頸鱗癌的治療起到巨大的推動(dòng)作用。
　　 在實(shí)體腫瘤組織中，氧含量的變化波動(dòng)于常氧甚至幾乎完全缺氧，并且不同程度低氧引起細(xì)胞低氧耐受的機(jī)制不同。最新的研究進(jìn)展表明，非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)依賴途徑是腫瘤適應(yīng)低氧的重要途徑，并

4、且在腫瘤組織中存在特異性激活。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）是UPR發(fā)生的標(biāo)志性因子和中心調(diào)控因子，對(duì)多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到了重要作用，但在頭頸鱗癌中低氧是否引起UPR的特異性激活，以及其激活對(duì)頭頸鱗癌化療敏感性的作用至今還不清楚。
　　 本研究將從檢測(cè)下咽癌組織中UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)情況入手，進(jìn)一步檢測(cè)低氧情況下，UPR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其

5、與化療敏感性的關(guān)系，從靶向腫瘤適應(yīng)低氧的UPR途徑找到克服頭頸鱗癌低氧治療抵抗的有效方法，為減少下咽癌的復(fù)發(fā)和改善預(yù)后提供理論基礎(chǔ)和方法學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)分為三部分:
　　 第一部分 UPR相關(guān)蛋白GRP78及CHOP在下咽癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系
　　 目的:檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白GRP78及CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)，并與臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)分析，探討其在下咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 方法:
　　

6、 1、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)47例下咽癌組織及12例癌旁正常下咽粘膜組織中GRP78及CHOP的表達(dá)，并與臨床諸病理因素進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 2、Western blot技術(shù)檢測(cè)4例下咽癌患者癌組織和癌旁正常下咽組織中GRP78及CHOP的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組化結(jié)果
　　 1.1、GRP78和CHOP在下咽癌組織及癌旁組織中的表達(dá):47例下咽癌中有41例GRP78表達(dá)陽性（陽性率87.2

7、3％），26例CHOP表達(dá)陽性（陽性率55.32％）。12例癌旁正常下咽組織中GRP78表達(dá)陽性率為33.33％，CHOP表達(dá)陽性率為0％。與癌旁正常下咽粘膜比較，下咽腫瘤組織中GRP78與CHOP的陽性表達(dá)率均明顯升高(x2=12.512，P=0.000;x2=11.868，P=0.001)。
　　 1.2、GRP78及CHOP與下咽癌臨床病理因素的關(guān)系:GRP78在中低分化的下咽癌組織中表達(dá)陽性率為94.87％，明顯高于高分

8、化組織，其陽性表達(dá)率為50.00％（=8.311，P=0.004）;CHOP在中低分化的表達(dá)陽性率是58.97％，在高分化組織中陽性表達(dá)率37.5％，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.522，P=0.470）。GRP78在T3-T4期陽性表達(dá)率為96.55％，明顯高于T1-T2期72.22％的陽性表達(dá)率(x2=3.921，P=0.048);CHOP在T3-T4與T1-T2期陽性表達(dá)率分別為51.72％與55.56％，二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（x2=0.065，P=0.798）。GRP78在Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達(dá)率為97.14％，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期，其陽性表達(dá)率為58.33％(x2=8.852，P=0.003);CHOP在Ⅲ-Ⅳ期、Ⅰ-Ⅱ期的陽性表達(dá)率分別為57.14％和50％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.184，P=0.668）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中GRP78的表達(dá)率明顯增高，陽性率為100％(x2=7.499，P=0.006);CHOP表達(dá)陽性率為53.57％(x2=0.086

10、，P=0.770);GRP78在下咽癌組織中的表達(dá)與腫瘤的病理分化程度、腫瘤T分期、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者的年齡、性別及腫瘤生長部位無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。CHOP的表達(dá)與病理分化程度、腫瘤T分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其它臨床病理因素均無明顯關(guān)性(P＞0.05)。
　　 2、Western blot檢測(cè)4例下咽癌患者癌組織中GRP78及CHOP的表達(dá)均較癌旁正常下咽組織的表達(dá)明顯升高。
　　 結(jié)論:

11、UPR相關(guān)蛋白GRP78及CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織均明顯升高，提示下咽癌組織中存在UPR的激活。
　　 第二部分慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定干擾GRP78下咽癌FaDu細(xì)胞系的建立
　　 目的:構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定干擾GRP78基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系，為后續(xù)研究GRP78在下咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供細(xì)胞模型。
　　 方法:
　　 1、針對(duì)GRP78基因序列由GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)合成4

12、條shRNA并構(gòu)建RNAi慢病毒載體，均經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染（blank）及轉(zhuǎn)染亂碼序列載體(scshRNA)做陰性對(duì)照。采用脂質(zhì)體法將慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot篩選出具有顯著敲減作用的LV-GRP78-shRNA。
　　 2、將對(duì)GRP78基因敲減作用最明顯的慢病毒載體LV-GRP78-shRNA2與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生慢病毒顆粒，將純化的慢病毒

13、顆粒感染人下咽癌FaDu細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定沉默GRP78的下咽癌FaDu細(xì)胞。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)定干涉GRP78的細(xì)胞株的熒光表達(dá)效率。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后FaDu細(xì)胞中GRP78的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、慢病毒載體LV-GRP78-shRNA2，LV-GRP78-shRNA3，LV-GRP78-shRNA4感染293T

14、細(xì)胞后，GRP78mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯減少，其中以LV-GRP78-shRNA2作用最為顯著。
　　 2、用最優(yōu)篩選濃度為2.5μg/ml的嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定干擾GRP78的FaDu細(xì)胞克隆。
　　 3、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光表達(dá)效率，未轉(zhuǎn)染組、亂序干涉載體組及穩(wěn)定敲低GRP78組的FaDu細(xì)胞，分別為0.833±0.115％，99.93±0.058％及99.97±0.058％。
　　 4、經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量

15、PCR檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞LV-GRP78-shRNA2組分別與亂序?qū)φ战M（scshRNA）及空白對(duì)照組(blank)比較GRP78mRNA水平均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.900，P=0.000;t=-28.604，P=0.000）。亂序?qū)φ战M與空白對(duì)照組比較GRP78mRNA水平無明顯變化（t=1.943，P=0.124）。
　　 5、Western blot法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞LV-GRP

16、78-shRNA2組分別與亂序?qū)φ战M（scshRNA）及空白對(duì)照組(blank)比較GRP78蛋白水平均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.388，P=0.000; t=-13.004，P=0.000）。亂序?qū)φ战M與空白對(duì)照組比較GRP78蛋白水平無明顯變化(t=0.066; P=0.951)。
　　 結(jié)論:利用慢病毒載體成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾GRP78基因的下咽癌FaDu細(xì)胞系，為后續(xù)研究該基因的功能提供細(xì)胞模型。
　　

17、 第三部分重度低氧激活UPR與GRP78-shRNA對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞的化療敏感性的影響及作用機(jī)制
　　 目的:觀察不同程度低氧對(duì)UPR的激活作用及對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步研究低氧誘導(dǎo)GRP78的表達(dá)在下咽癌化療抵抗中的作用，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:本研究于常氧及不同程度低氧培養(yǎng)F aDu細(xì)胞，檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，同時(shí)檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)FaDu細(xì)胞的增殖抑制作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，并

18、檢測(cè)敲減GRP78聯(lián)合順鉑治療對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　 1、免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP在常氧(20％ O2)、中度(1％O2)及重度低氧(＜0.02％O2)低氧培養(yǎng)條件下的表達(dá)。
　　 2、Western blot方法檢測(cè)下咽鱗癌FaDu細(xì)胞GRP78與CHOP在常氧及不同程度低氧培養(yǎng)條件下3，6，9，12及24h表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 3、MTT法檢測(cè)順鉑在常氧、中度及重度低氧

19、培養(yǎng)條件下對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖的抑制作用，并觀察敲減GRP78聯(lián)合順鉑在常氧及重度低氧培養(yǎng)條件下對(duì)FaDu細(xì)胞增殖的影響。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)PI法檢測(cè)在常氧、重度低氧培養(yǎng)條件下敲減GRP78聯(lián)合順鉑治療對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響。
　　 5、分別對(duì)FaDu細(xì)胞GRP78未敲減（GRP78（+/+））和GRP78敲減(GRP78(-/-)）細(xì)胞系進(jìn)行常氧和重度低氧培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)24小時(shí)GRP78和CH

20、OP的表達(dá)變化。
　　 6、Western blot檢測(cè)在常、低氧培養(yǎng)條件下敲減GRP78對(duì)凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Bcl-2及Bax的表達(dá)調(diào)控。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP在不同程度低氧培養(yǎng)條件下的表達(dá):下咽鱗癌FaDu細(xì)胞在中度低氧培養(yǎng)24h較常氧培養(yǎng)組比較GRP78與CHOP的表達(dá)均無明顯變化（t=0.459，P=0.67; t=0.226，P=0.832）

21、，而重度低氧培養(yǎng)24h較常氧組比較，GRP78的表達(dá)明顯升高，有非常顯著性差異（t=14.709，P=0.000）;CHOP的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.432，P=0.011）。GRP78與CHOP在重度低氧組的表達(dá)較中度低氧組比較均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=13.055，P=0.000;t=3.85，P=0.018）。
　　 2、Western blot檢測(cè)GRP78與CHOP在常氧及不同程度低氧培養(yǎng)條件下的表

22、達(dá)變化，結(jié)果顯示:FaDu細(xì)胞在中度低氧培養(yǎng)3，6，9，12及24h時(shí)GRP78與CHOP的表達(dá)較常氧培養(yǎng)組均無明顯變化(P＞0.05);低氧標(biāo)志性蛋白HIF-1α于低氧6h至24h逐漸升高，24h達(dá)峰值。GRP78在重度低氧培養(yǎng)3h至9h逐漸升高，9h至24h維持在較高水平，與常氧培養(yǎng)組比較有顯著性差異（3h，6h，P＜0.05;9h，12h，24h，P＜0.01）。CHOP在重度低氧培養(yǎng)12h開始升高，24小時(shí)達(dá)到高峰，與常氧培養(yǎng)組

23、比較有顯著性差異（12h，P＜0.05;24h，P＜0.01）。與常氧組比較，HIF-1α在重度低氧培養(yǎng)條件下3h已明顯升高，6h至12h維持在較高水平，24h有明顯下降，但仍高于常氧水平。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3h，6h，9h，P＜0.01;12h，24h, P＜0.05)。
　　 3、MTT檢測(cè)結(jié)果
　　 3.1、不同程度低氧培養(yǎng)條件下順鉑對(duì)FaDu細(xì)胞增殖的影響:中、重度低氧較常氧比較均可導(dǎo)致順鉑對(duì)FaDu細(xì)胞的增殖抑

24、制作用降低(F=25.692，P=0.013，P＜0.05;F=181.063，P=0.000，P＜0.01)，以重度低氧組較為顯著。重度低氧培養(yǎng)條件下，順鉑對(duì)FaDu細(xì)胞的增殖抑制作用較中度低氧亦明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=80.537，P=0.000; P＜0.01)。
　　 3.2、敲減GRP78聯(lián)合順鉑在常氧及重度低氧培養(yǎng)條件下對(duì)FaDu細(xì)胞增殖的影響:重度低氧培養(yǎng)條件下，順鉑對(duì)GRP78(+/+)與GRP78(-/

25、-)細(xì)胞的增殖抑制作用較常氧比較均明顯降低(F=84.153，P=0.000，P＜0.01;F=211.988，P=0.000，P＜0.01)，GRP78(-/-)細(xì)胞分別于常氧、低氧培養(yǎng)條件下，較GRP78(+/+)組比較，順鉑對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用均明顯升高（F=75.301，P=0.000,P＜0.01;F=138.500,P=0.000,P＜0.01）。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 低氧培養(yǎng)條件下

26、，F(xiàn)aDu細(xì)胞的凋亡率較常氧組比較明顯減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-4.525，P=0.011，P＜0.05），GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較，常氧培養(yǎng)24h凋亡率無明顯變化（t=2.158，P=0.097，P＞0.05），而低氧培養(yǎng)條件下的凋亡率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.213，P=0.016，P＜0.05）。常氧及重度低氧培養(yǎng)條件下，GRP78（-/-）化療組較GRP78(+/+)化療組比較凋亡率均明顯升高

27、，且以低氧培養(yǎng)條件下升高更為顯著（t=8.827，P=0.011,P＜0.05; t=12.803,P=0.000,P＜0.01）。
　　 5、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)敲減GRP78對(duì)CHOP的影響
　　 FaDu細(xì)胞在常氧、重度低氧培養(yǎng)24h時(shí)GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較GRP78的表達(dá)均有明顯下降（t=-3.769，P=0.023，P＜0.05; t=-6.742，P=0.003，P＜0.01）;GRP

28、78（-/-）組較GRP78(+/+)組比較，常氧培養(yǎng)24h時(shí)CHOP的表達(dá)無明顯變化（t=0.331，P=0.767，P＞0.05），而低氧組CHOP的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.616，P=0.005，P＜0.01）。
　　 6、Western blot檢測(cè)GRP78對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 GRP78在常氧、重度低氧培養(yǎng)條件下GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較表達(dá)均明顯降低（t=-

29、10.052，P=0.006，P＜0.01;t=-12.209，P=0.006，P＜0.01）;CHOP在重度低氧培養(yǎng)條件下較常氧組比較表達(dá)明顯升高（t=3.418，P=0.025，P＜0.05）。GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較，常氧培養(yǎng)24h時(shí)CHOP的表達(dá)無明顯變化(t=0.08，P=0.94，P＞0.05)，而在低氧組CHOP的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.24，P=0.013，P＜0.05）。Bcl

30、-2和Bax在常氧培養(yǎng)條件下GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較表達(dá)均無明顯變化(P＞0.05)。低氧培養(yǎng)24h時(shí)，Bcl-2較常氧組比較表達(dá)明顯升高（t=5.569，P=0.005，P＜0.01），Bax的表達(dá)明顯降低（t=-3.081，P=0.037，P＜0.05）。低氧培養(yǎng)24h時(shí)，GRP78(-/-)組較GRP78(+/+)組比較Bcl-2明顯降低（t=-13.25，P=0.000，P＜0.01），Bax的表達(dá)明顯

31、升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=17.127，P=0.000，P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1、重度低氧在人下咽鱗癌FaDu細(xì)胞中可激活UPR，導(dǎo)致GRP78和CHOP的表達(dá)升高，而中度低氧在觀測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)不能激活UPR。
　　 2、低氧可造成下咽癌FaDu細(xì)胞的化療抵抗，并且低氧程度越重，化療抵抗越明顯。
　　 3、重度低氧誘導(dǎo)GRP78表達(dá)升高，與下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖及化療耐受密切相關(guān)。敲減GRP