自噬對成骨細胞在酸性微環(huán)境中的保護作用及其機制的初步研究.pdf

1、現(xiàn)代外科學的發(fā)展為骨折的治療帶來了新的理念和技術(shù)，但術(shù)后骨不連的發(fā)病率仍舊很高，因此骨折愈合的機制及影響因素仍有待于深入研究。成骨細胞在骨折愈合中扮演重要的角色，其增殖分化與骨折周圍的微環(huán)境息息相關(guān)，因此，研究成骨細胞在骨折局部微環(huán)境中的反應(yīng)有著非常重要的意義。自噬可避免細胞受外界不利環(huán)境的影響，是用來維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡與穩(wěn)定的重要保護機制。研究表明，缺血、低氧和氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致自噬的發(fā)生。然而，骨折局部同樣存在酸性的微環(huán)境，但是酸性微

2、環(huán)境是否誘導(dǎo)成骨細胞發(fā)生自噬目前尚不清楚。因此，對成骨細胞所在酸性微環(huán)境中的自噬反應(yīng)以及相關(guān)機制進行研究，可能為促進骨愈合以及骨折術(shù)后骨不連的防治提供新的思路。
　　目的:
　　本研究通過構(gòu)建小鼠骨折模型，分析骨折斷端周圍能否發(fā)生自噬反應(yīng)。通過體外細胞實驗?zāi)M骨折周圍的酸性微環(huán)境，分析酸性環(huán)境對成骨細胞活力和凋亡的影響，以及酸性微環(huán)境下成骨細胞是否能發(fā)生保護性自噬反應(yīng)，從而提高成骨細胞的存活率，為促進骨折愈合提供新的策略。<

3、br>　　方法:
　　1.動物實驗分組及方法
　　實驗選取27只體重在(30±10)g，6周齡雄性KM大鼠，并隨機分為3組:A組(6h)，B組(24h)，C組(36h)，每組9只。小鼠右側(cè)股骨建立骨折損傷，左側(cè)正常側(cè)作為對照。A，B，C三組大鼠分別在骨折6h，24h，36h后處死，取下骨折及正常側(cè)骨組織作為樣本，樣本固定、骨組織脫鈣、石蠟包埋、切片，進行組織免疫熒光染色，檢測標志蛋白LC3，p62的表達水平。
　　2.

4、細胞實驗的分組及方法
　　實驗按pH的不同將培養(yǎng)基隨機分為三組分別為pH6.4、6.8（實驗組）及7.4組（對照組）。成骨細胞培養(yǎng)在96孔板內(nèi)，經(jīng)過不同pH的培養(yǎng)基處理12h，24h，48h時間后，采用MTT比色法檢測酸性微環(huán)境下成骨細胞的細胞活力;細胞在不同pH的培養(yǎng)基內(nèi)處理24h后，采用AnnexinV-PI染色法檢測不同pH培養(yǎng)基對成骨細胞凋亡的影響;細胞免疫熒光用來檢測，經(jīng)不同pH的培養(yǎng)基處理6h后，LC3在細胞內(nèi)的表達;

5、透射電鏡觀察pH6.4的培養(yǎng)基處理6h后自噬小體的數(shù)量及其形態(tài)的變化;免疫蛋白印記法檢測自噬標志蛋白LC3及p62的表達以及轉(zhuǎn)化以及監(jiān)測酸性微環(huán)境下成骨細胞自噬流的產(chǎn)生。通過添加自噬抑制劑CQ抑制成骨細胞自噬反應(yīng)，檢測不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后細胞凋亡情況，分析酸性微環(huán)境下自噬對凋亡的影響。采用SPSS16.0軟件包進行分析，單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。
　　結(jié)果:
　　1.動物免疫熒光觀察顯示:免疫熒光用來檢測LC3及p

6、62的表達。骨折組，骨折斷端LC3的表達相比對照組要強(p＜0.05)，相反p62表達較對照組弱)(p＜0.05）。即骨折斷端發(fā)生了自噬。
　　2.MTT比色法顯示:實驗組(pH6.4、6.8)與對照組(pH7.4)相比，在各個時間點(12h，24h，48h)細胞活力均小于對照組(p＜0.05），即酸性環(huán)境下成骨細胞的細胞活力受到抑制，與pH6.8組相比pH6.4組細胞活力更低，其差異具有顯著性(p＜0.05）。即酸性pH微環(huán)境對

7、成骨細胞的細胞活力是不利的且呈pH及時間依賴性。
　　3.AnnexinV-PI染色法顯示:24小時后，pH6.4和pH6.8組細胞凋亡數(shù)目較正常組pH(7.4)明顯增多，且pH6.4組細胞凋亡數(shù)最多。即酸性微環(huán)境促使成骨細胞凋亡，其差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　4.電鏡觀察顯示:成骨細胞在酸性為pH6.4的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6h后，自噬小體數(shù)目較正常組pH(7.4)明顯增多，成骨細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，呈雙層膜包裹著細

8、胞器或線粒體。即酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)成骨細胞發(fā)生自噬反應(yīng)。
　　5.蛋白質(zhì)免疫印記檢測顯示:pH6.4時，隨著時間的延長(6h，12h，24h)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值變低(p＜0.05），而p62逐漸升高(p＜0.05）;即隨著時間延長自噬減弱;6h時，隨著pH的升高(pH6.4，6.8，7.4) LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，相反p62逐漸升高(p＜0.05），即酸性pH越低，自噬越強。在相同條件加入自噬抑制劑氯喹后，因其阻礙了自噬小體與溶

9、酶體的結(jié)合，導(dǎo)致LC3-Ⅱ的表達明顯增加。即隨著時間的延長自噬減弱。
　　6.細胞免疫熒光檢測顯示:細胞在pH6.4的培養(yǎng)液處理6h后，采用免疫熒光檢測LC3，紅色熒光分布在細胞質(zhì)內(nèi)，且隨pH的升高，熒光表達降低(p＜0.05)。說明酸性微環(huán)境可以促進自噬。
　　7.加入自噬抑制劑后AnnexinV-PI染色法顯:在相同的條件下，加入自噬抑制劑組比不加入抑制劑組細胞凋亡數(shù)明顯增多(p＜0.05）。即在酸性微環(huán)境下，抑制自噬，