自噬在成骨細胞氧化應激中的作用及其與骨質疏松的關系研究.pdf

1、第一部分骨質疏松骨組織中骨細胞自噬增加及其與氧化應激和骨量的關系
　　目的:探討骨質疏松大鼠骨組織中骨細胞是否存在自噬，以及與氧化應激的關系。
　　方法:通過去卵巢建立骨質疏松大鼠模型，將36只6周齡SD大鼠隨機分為假手術組，去卵巢組（OVX組）和去卵巢加雌激素治療組(OVX+E2)。6周后，通過micro-CT和DEXA檢測骨微細結構和骨量，透射電鏡觀察骨細胞胞漿內自噬體以及細胞器的變化，免疫熒光法、Western blo

2、t和qRT-PCR檢測自噬特異性基因BECN-1、p62/SQSTM1以及Map1-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達。并通過ELISA檢測血漿內雌激素水平、骨組織內T-AOC、SOD、CAT等抗氧化酶活性。此外，分析自噬與氧化應激的相關性。
　　結果:骨質疏松模型大鼠骨細胞，透射電鏡下細胞胞漿內可見較多環(huán)狀結構物質，該物質有自噬體特異性的雙層膜結構，同時Western blot檢測自噬相關基因p62/SQSTM1、BECN-1以及Map1-L

3、C3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達增加。免疫熒光檢測結果顯示，骨質疏松動物模型骨細胞胞漿內Map1-LC3蛋白的表達明顯增高;而骨組織內抗氧化酶活性明顯下降，提示在此過程中細胞自噬與抗氧化酶相關。
　　結論:骨質疏松模型大鼠骨細胞自噬增強，且與氧化應激相關，但自噬與氧化應激的關系有待進一步實驗明確。
　　第二部分內質網(wǎng)應激介導自噬減輕成骨細胞氧化應激損傷
　　目的:氧化應激誘導成骨細胞凋亡在骨質疏松病理過程中起重要作用，但自噬在成骨

4、細胞氧化應激、凋亡中的作用尚未明確。本項研究的目的在于觀察自噬對成骨細胞氧化應激損傷中的作用，并借此觀察細胞自噬與凋亡之間的關系。
　　方法:給予不同濃度(0.1、1、10 mM)過氧化氫(H2O2)刺激Mc3T3-E1細胞;在不同時間(0、2、6、8、12h)，采用透射電鏡觀察自噬體，MDC和LysoTracker染色檢測細胞內的自噬溶酶體活性，Western blot檢測自噬相關蛋白BECN-1、Map1-LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達

5、變化，DCFH-DA熒光染色檢測細胞內的ROS水平;AnnexinⅤ/PI檢測細胞凋亡率;應用Rap，3-MA和Baf-A1自噬調節(jié)劑觀察細胞內的ROS水平，以明確自噬和凋亡之間的相互影響。Western blot檢測內質網(wǎng)應激相關蛋白表達變化，包括p-PERK、PERK、IRE1、PDI、GRP-78蛋白表達變化。隨后應用Talen技術敲除PERK、IRE1和GRP-78基因后，檢測細胞自噬變化，明確內質應激與自噬的關系。最后，分別應

6、用GFP-LC3標記自噬體，RFP標記線粒體，免疫熒光定位在氧化應激條件下Mc3T3-E1細胞線粒體和自噬體位置分布變化，以明確線粒體損傷與自噬的關系。
　　結果:過氧化氫誘導成骨細胞的凋亡和自噬，呈劑量和時間依賴性;自噬抑制劑(3-MA，Baf-A1)可顯著增強過氧化氫誘導的細胞內ROS水平及凋亡率，Westernblot證實cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白增加;自噬誘導劑(Rap)部分抑制氧化氫

7、誘導氧化應激和凋亡;氧化應激誘導線粒體膜電位下降，線粒體細胞色素C等釋放增加。在過氧化氫處理2小時后，免疫熒光共定位顯示線粒體和自噬體的重疊度為23％。此外，過氧化氫誘導內質網(wǎng)應激，阻斷內質網(wǎng)關鍵信號分子GRP-78或者PERK，導致細胞自噬受阻，凋亡增加。
　　結論:通過內質網(wǎng)途徑，自噬減輕成骨細胞氧化應激。自噬抑制氧化應激介導的凋亡，自噬是骨質疏松治療潛在的靶點。
　　第三部分 BECN-1基因對MC3T3-E1成骨細胞

8、增殖、分化和凋亡的影響
　　目的:自噬抑制成骨細胞氧化應激，但具體機制尚不清楚。BECN-1是自噬關鍵調控基因，研究證實BECN-1在衰老，骨關節(jié)炎等退變性疾病過程中的發(fā)揮重要作用。然而，BECN-1在骨質疏松和骨形成中的作用尚不清楚。本項研究的目的在于觀察BECN-1基因對成骨細胞增殖、分化和凋亡的影響。
　　方法:應用慢病毒(pGC-FU-3FLAG-BECN-1)和Talen技術分別構建過表達和干擾BECN-1基因載體

9、，建立BECN-1過表達和沉默細胞系;CCK-8檢測成骨細胞增殖率;流式檢測BECN-1基因過表達和沉默對細胞周期影響;成骨誘導分化4周，茜素紅染色檢測成骨細胞礦化能力;成骨誘導分化48hrs，qRT-PCR和westem blot檢測成骨分化相關Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達水平;最后，AnnexinⅤ-PE/7AAD染色流式細胞檢測BECN-1基因對成骨細胞凋亡的影響。
　　結果:成功構建穩(wěn)定BECN-1過表達

10、和沉默的Mc3T3-E1細胞系;CCK-8檢測結果顯示:BECN-1基因沉默導致細胞增殖受抑制，但是BECN-1過表達細胞增殖能力無明顯改變;流式檢測細胞周期結果顯示BECN-1過表達細胞無明顯變化，BECN-1基因沉默導致細胞周期停滯于S期;成骨誘導分化4周，BECN-1基因沉默細胞礦化結節(jié)數(shù)量明顯減少，而BECN-1過表達不影響細胞礦化能力;成骨誘導分化48 hrs，qRT-PCR和western blot檢測結果示BECN-1基因

11、沉默抑制Runx2、OCN、COL-1基因和蛋白的表達，而BECN-1過表達對成骨分化相關基因表達影響不明顯。過氧化氫處理12 hrs，BECN-1基因沉默導致細胞更易受過氧化氫損傷，成骨細胞凋亡率升高，而BECN-1過表達則抑制成骨細胞凋亡。
　　結論:自噬基因BECN-1沉默導致成骨細胞增殖和分化受抑制，同時BECN-1基因沉默導致細胞更易受氧化應激損害，凋亡增加。而BECN-1過表達則增強成骨細胞抗氧化能力，凋亡減少。BEC