高良姜提取物抑制氧化應(yīng)激引起的成骨細(xì)胞損傷和凋亡的作用研究.pdf

1、[目的]：
　　1.篩選高良姜促成骨分化的活性組分。
　　2.探討H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激引起成骨細(xì)胞損傷和凋亡以及高良姜抗骨質(zhì)疏松活性組分的干預(yù)作用。
　　3.闡明H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激對FoxO/Wnt信號通路的影響以及高良姜抗骨質(zhì)疏松活性組分的干預(yù)作用。
　　[方法]：
　　1.高良姜干燥根莖粉碎后，98％乙醇萃取五次，溶液經(jīng)濃縮蒸干后得到總提取物F1，F(xiàn)1用石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(36∶64∶2

2、)體系進(jìn)行洗脫后根據(jù)極性由高到低得到F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5和F6。用高效液相色譜法（HPLC）對F1-F6中高良姜素的含量進(jìn)行測定。色譜柱:phenomenex C18柱(46mm×250mm，5μm);流動相:乙腈-0.2％磷酸(48∶52);檢測波長:266.8nm;流速:1.0ml/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μl。
　　2.采用酶消化法體外培養(yǎng)和純化新生大鼠成骨細(xì)胞(OBs)，采用ALP染色、茜素紅染色、HE染色及細(xì)

3、胞形態(tài)學(xué)觀察對原代成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為研究提供合格的靶細(xì)胞。
　　3.用MTT法、PNPP法、茜素紅染色法分別檢測高良姜各提取物對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力、堿性磷酸酶含量及鈣化結(jié)節(jié)面積的影響，以觀察提取物對成骨細(xì)胞增殖、分化及鈣化能力的作用及其時效及量效關(guān)系，為初步篩選高良姜活性成分提供依據(jù)。
　　4.應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，采用MTT法、PNPP法、茜素紅染色法分別檢測在氧化應(yīng)激狀態(tài)下高良姜各活性組分對氧化應(yīng)激介

4、導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　5.DCFH-DA探針法檢測高良姜各活性組分對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響;應(yīng)用Hoechst33258染色法觀察高良姜各組分對氧化應(yīng)激介導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　6.Western Blot法檢測高良姜各活性組分對成骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin及FoxO信號通路中關(guān)鍵蛋白FoxO3a、β-catenin及Tcf-4蛋白表達(dá)水平的影響。
　　[結(jié)果]：
　　1.高良姜各組

5、分中高良姜素的百分含量測定
　　HPLC法檢測高良姜各組分中高良姜素含量的結(jié)果顯示，F(xiàn)1-F6中高良姜素的含量分別為0.512％、0.095％、0.38％、24.42％、0.19％、0.04％。
　　2.成骨細(xì)胞分離與鑒定
　　酶消化法分離和純化得到的細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)均一，呈長梭形或者多角形，有少量雜細(xì)胞游離。傳代培養(yǎng)2代后，可得到純化的成骨細(xì)胞。ALP染色可見細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)大量紫色和深紫色顆粒，ALP染色陽性;茜素

6、紅染色結(jié)果顯示鈣結(jié)節(jié)經(jīng)過茜素紅染色后呈現(xiàn)出橘紅色。
　　3.高良姜促成骨分化活性組分的初步篩選
　　以高良姜素（galagin，10-4g/ml-10-8g/ml）為對照組， F1-F6均以濃度為10-4g/ml-10-8g/ml作用于成骨細(xì)胞24h、48h和72h，結(jié)果顯示，高良姜素10-5 g/ml濃度組在作用48h和72h能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P＜0.05)，而10-5 g/ml在作用24h和其他濃度組均未見明顯的促成骨

7、細(xì)胞增殖作用。F1濃度為10-5 g/ml、F4濃度為10-6 g/ml和10-5 g/ml、F5濃度為10-6 g/ml、10-5 g/ml和10-4 g/ml作用24h、48h和72h均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖（P＜0.05），且其促成骨細(xì)胞增殖作用較高良姜素組作用要強(qiáng)。而F2、F3和F6在作用24h、48h和72h后均未見明顯的促成骨細(xì)胞增殖作用。高良姜素（10-6 g/ml、10-5 g/ml）、F1(10-8 g/ml-10-5 g

8、/ml)、F4(10-8g/ml-10-5 g/ml)和F5(10-8 g/ml-10-5 g/ml)還能促進(jìn)成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá)(P＜0.05)，其中高良姜素和F1、F4在作用第五天時達(dá)到高峰，F(xiàn)5在第七天達(dá)到高峰。而F2、F3和F6各濃度組在各時間段均未見明顯的胞漿內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)的增加。高良姜素和F1-F6作用成骨細(xì)胞21d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，高良姜素、F1、F4和F5相對于對照組，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量和面積明顯增多，且在1

9、0-5 g/ml濃度組效果最佳。F2、F3和F6各濃度組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量和面積與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.氧化應(yīng)激對成骨分化的影響以及高良姜活性組分的干預(yù)作用
　　應(yīng)用濃度為l0-100μM的H2O2處理成骨細(xì)胞4h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，H2O2濃度為70μM-100μM時，細(xì)胞活力隨H2O2濃度增加而減少（P＜0.05），H2O2濃度為10μM-60μM時，細(xì)胞活力無明顯變化（P＞0.05）。

10、H2O2濃度90μM時，細(xì)胞活力下降50％，因此實驗采用90μM的H2O2來復(fù)制氧化應(yīng)激模型。H2O2能夠引起細(xì)胞活力，胞漿內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)水平及礦化結(jié)節(jié)數(shù)量與面積顯著性減少（P＜0.05），濃度為10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能H2O2對抗這種作用增加(P＜0.05)。
　　5.氧化應(yīng)激引起成骨細(xì)胞凋亡以及高良姜活性組分的干預(yù)作用
　　用濃度為90μM的H2O2處理成骨細(xì)胞30min后，細(xì)胞內(nèi)ROS增加率達(dá)

11、到36.8％（P＜0.05），濃度為10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能夠顯著地減少H2O2引起的ROS積累(P＜0.05)。90μM的H2O2作用于成骨細(xì)胞后，相對于對照組，凋亡小體和細(xì)胞核腫脹、碎裂數(shù)量增多(P＜0.05)，濃度為10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能夠顯著地減少成骨細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。
　　6.高良姜組分在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對FoxO/Wnt信號通路的影響
　　用90μM的H2O

12、2處理成骨細(xì)胞后，β-catenin和Tcf-4蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)oxO3a蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。濃度為10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能夠不同程度的逆轉(zhuǎn)H2O2的對β-catenin、FoxO3a的作用，引起β-catenin和Tcf-4蛋白表達(dá)增加，F(xiàn)oxO3a蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　[結(jié)論]：
　　1.高良姜提取物中F1、F4和F5可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。F2、F3和F6未見明顯

13、的促成骨增殖、分化和礦化作用。高良姜提取物中F1、F4和F5均可對抗H2O2對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的抑制作用。結(jié)果提示，高良姜各組分促成骨分化作用強(qiáng)弱可能與高良姜素含量多少有關(guān)。
　　2.高良姜提取物中F1、F4和F5能夠抑制H2O2引起成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，可能與其調(diào)控FoxO3a通路有關(guān)。
　　3.高良姜提取物中F1、F4和F5可能是高良姜抗骨質(zhì)疏松活性組分，其對抗H2O2引起的成骨細(xì)胞功能抑制可能與調(diào)控Wnt/β