丹參多酚對鐵過載引起的臍血造血細胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用.pdf

1、目的:探討丹參多酚對鐵過載引起的臍血造血細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。
　　方法:
　　1．臍帶血單個核細胞（UC-MNCs）的分離及培養(yǎng)臍帶血：羥乙基淀粉=4:1的比例要求混合均勻，在室溫20-25℃條件下自然沉淀1.5小時。吸白膜層，按1:5的比例加NH4Cl紅細胞裂解液混勻，避光靜置10min，離心棄上清，1640培養(yǎng)液洗滌2遍后，采用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的1640的培養(yǎng)液）懸浮單個核細胞。顯微鏡下計數(shù)細胞，調(diào)整

2、至1×106/mL的細胞密度，并接種于12孔培養(yǎng)板中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
　　2．鐵過載細胞模型建立及細胞分組枸櫞酸鐵胺（FAC）組及丹參多酚低、中、高劑量組以FAC400μmol/L濃度建立鐵過載細胞模型，于培養(yǎng)第2天加入含上述濃度的FAC的培養(yǎng)液，此后每24小時使用1640培養(yǎng)液更換液體，制備鐵過載細胞模型，共在400μmol/L FAC中培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)第3天，丹參多酚低劑量組加入18

3、μg/mL丹參多酚、中劑量組加入50μg/mL丹參多酚、高劑量組加入160μg/mL丹參多酚，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。對照組則不需要加任何試劑，常規(guī)培養(yǎng)96小時。
　　3．鐵過載細胞模型鑒定鈣熒光素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）是可對所有存活狀態(tài)的細胞進行檢測的試劑，其本身具有熒光標記特性，可以很容易的進入存活細胞的細胞膜，到達細胞質(zhì)后，calcein做為酯酶水解產(chǎn)物留在細胞內(nèi)，發(fā)強綠色熒光。Calcein不能透過細胞膜而滯留在胞

4、質(zhì)與鐵可逆性結(jié)合，從而使熒光淬滅。細胞培養(yǎng)96小時后，收集FAC組、對照組細胞，用1640培養(yǎng)液將細胞洗滌2次，顯微鏡下計數(shù)細胞，調(diào)整至1×106/mL的細胞密度，加入calcein-AM，終濃度為0.125μmol/L，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS洗滌細胞2次后，在激發(fā)光波長為496nm，吸收光波長為516nm下采用流式儀，對每一組細胞檢測其平均熒光強度水平，經(jīng)測FAC組、對照組LIP熒光強度分別為（4

5、5.20±8.30）、（78.21±9.47），F(xiàn)AC組可變鐵池（LIP）熒光強度低于對照組，證實FAC組關(guān)于鐵過載的細胞模型成功建立。
　　4.細胞內(nèi)氧化應(yīng)激（ROS）水平根據(jù)試劑盒的相關(guān)說明完成操作，使用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）標記臍帶血單個核細胞，DCFH-DA為非熒光脂類可滲透性成分，進入細胞，隨之被酯酶水解，生成產(chǎn)物DCFH，后者由于ROS的存在，被氧化成非滲透性熒光成分DCF，DCF具有的熒光強

6、度較胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS成正相關(guān)。細胞培養(yǎng)96小時后，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，加入10 mmol/L的2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽，使其最終濃度達到1μmol/L，并加入10μlCD33-PE（或20μlGlyA-PE），分別標記于粒細胞以及紅細胞。于37℃避光溫育20 min，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，于激發(fā)光波長488nm，吸收光波長為525nm條件下，采用流式儀分別檢測各實驗組ROS水平。實驗重復(fù)3次。
　　5

7、.細胞凋亡率細胞培養(yǎng)96小時后，依照試劑盒具體說明，按步驟完成操作，使臍血單個核得細胞密度調(diào)整為1×106/mL。取100μL細胞懸浮液于流式管中，加5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL碘化丙啶，混合均勻后，予以日常室溫放置，并避光進行孵育15 min，隨后采用流式儀對各個實驗組樣本進行凋亡率檢測。實驗重復(fù)3次。
　　6.細胞集落計數(shù)細胞培養(yǎng)96小時后，收集各個實驗組的UC-MNCs，1640培養(yǎng)液洗滌細胞2次，后重新懸浮

8、細胞，并予以計數(shù)。在24孔培養(yǎng)板中進行集落培養(yǎng)，每孔中設(shè)定甲基纖維素半固體培養(yǎng)基0.5 mL，加入各組 MNCs1×105個。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14天后，分別在顯微鏡下對紅系祖細胞集落形成單位（CFU-E）、粒-單核系祖細胞集落形成單位（CFU-GM）、爆式紅系祖細胞集落形成單位（BFU-E）和混合祖細胞集落形成單位（CFU-mix）進行計數(shù)。實驗重復(fù)3次。
　　結(jié)果:
　?、?FAC組（703.16±54

9、.47）ROS水平較對照組（163.74±7.43）升高（p<0.05），丹參多酚的低劑量、中劑量、高劑量組（414.40±21.93；415.31±14.11；185.91±7.24）較FAC組ROS水平降低（p<0.05）。
　?、?FAC組細胞的凋亡增高，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異，（p<0.05）。丹參多酚高劑量組與FAC組相比凋亡減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　③ FAC與對照組相比，F(xiàn)AC組細胞集落