丹參注射液對鐵超載所致心臟、肝臟損傷的保護(hù)作用及鈣通道抑制作用的研究.pdf

1、鐵是人體必需的微量元素之一，它不僅參與細(xì)胞血紅素的構(gòu)成，還參與細(xì)胞的增殖和分化，并且通過催化氧化-還原反應(yīng)參與機(jī)體的能量代謝、解毒等重要生理過程，同時(shí)它也參與調(diào)節(jié)NOS、PKC-β等與細(xì)胞生長功能有關(guān)的基因表達(dá)。但是當(dāng)體內(nèi)鐵超載時(shí)，則引起器官的廣泛受損。心臟、肝臟等是鐵超載受損的主要靶器官。自1981年Swanson提出機(jī)體鐵不斷增加是冠心病的危險(xiǎn)因素以來，鐵超載致心臟損傷一直成為鐵超載研究的熱點(diǎn)。另外，肝臟是機(jī)體鐵貯存和代謝的重要臟器

2、，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中加入非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵，可導(dǎo)致肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，鐵超載可使機(jī)體內(nèi)有氧化活性游離鐵大量增加，從而促進(jìn)OH·的產(chǎn)生，目前認(rèn)為OH·是體內(nèi)最具有損傷性的自由基，它能攻擊線粒體雙層磷脂中不飽和脂肪酸，產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化物，從而導(dǎo)致線粒體膜功能的損傷如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)等，這會進(jìn)一步影響整個(gè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織壞死，這可能是鐵超載致器官損傷的重要機(jī)制之一。
　　目前，臨床鐵超載疾病的治療藥

3、物主要是鐵的螯合劑，如去鐵胺（Deferoxamine，DFO）、去鐵酮(Deferiprone，DFP)、去鐵斯若(Deferasirox，DFS)等，其中DFO是目前廣泛應(yīng)用治療鐵超載疾病的藥物。DFO具有減少自由基形成、抑制脂質(zhì)過氧化等作用，但DFO也有很多副作用，可引起低血壓、心悸等不良反應(yīng)，長期靜脈注射治療會引起病人耐受性差、生活質(zhì)量下降等問題。近年有研究發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑如維拉帕米可以抑制機(jī)體脂質(zhì)過氧化、逆轉(zhuǎn)鐵超載，但是其作用

4、機(jī)制尚未完全明確。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療鐵超載的研究很少，國內(nèi)有學(xué)者從黃芩中提取黃芩苷、從碩苞薔薇中提取兒茶素和漆黃素來治療鐵超載所致臟器損傷，發(fā)現(xiàn)黃芩苷、兒茶素和漆黃素具有抗氧化和鐵螯合劑雙重作用，但缺點(diǎn)是黃芩苷由于在黃芩中含量低難以提取。因此，研究開發(fā)一種新的藥物治療鐵超載疾病有著非常重要的意義。
　　丹參是屬于唇形科鼠尾草植物丹參（Salvia miltiorrhiza，Labiataefamily）的干燥根，是中國傳統(tǒng)的中草藥之一

5、，具有活血化瘀、涼血、去癰、平燥等功效，現(xiàn)代研究證實(shí)丹參還具有降低氧自由基生成、抑制鈣離子通道等作用。丹參注射液（丹參的水提物）在臨床上極為常用，廣泛用于治療心血管疾病和肝、腎功能障礙等疾病，是一種簡便價(jià)廉的中藥制劑。近年來對丹參注射液的基礎(chǔ)和臨床研究已逐漸成為熱點(diǎn)。我們的前期研究表明，丹參能減少斑馬魚肝臟、心臟和腎臟鐵沉積，抑制脂質(zhì)過氧化;此外，前期研究還證實(shí)丹參注射液對其它一些二價(jià)金屬離子如鉛中毒小鼠腎臟損傷也有保護(hù)作用。因此，丹參

6、是潛在的治療鐵超載和其他金屬離子所致臟器損傷的藥物，其作用及機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究證實(shí)。
　　綜上所述，近年來有關(guān)鐵超載引起的健康問題尤其是對心臟、肝臟等重要臟器的損傷逐漸引起人們關(guān)注。除DFO等鐵螯合劑外，其它治療鐵超載的藥物報(bào)道亦逐年增加，但丹參注射液對鐵超載致心臟及肝臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究論文主要從分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、離子通道水平深入探討丹參注射液對鐵超載致臟器損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，主要包

7、括以下內(nèi)容:(1)丹參注射液對鐵超載致小鼠急性心臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制;(2)丹參注射液對鐵超載致急性肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制;(3)丹參注射液對大鼠心肌細(xì)胞鈣電流及鈣瞬變的影響。論文具體內(nèi)容如下:
　　第一部分丹參注射液對鐵超載所致心臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的:測定丹參注射液的活性成分及其含量;深入探討丹參注射液對鐵超載所致小鼠心臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:通過高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)定

8、量測定丹參注射液的主要活性成分及其含量。將60只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組:對照組、鐵超載組、丹參高劑量組、丹參低劑量組和DFO組。除對照組腹腔注射生理鹽水外，其它各組均腹腔注射右旋糖酐鐵注射液(50 mg/kg/d)。給予右旋糖酐鐵4h后，丹參高、低劑量組小鼠再分別注射丹參注射液(4 ml/kg/d、2ml/kg/d)及DFO(100 mg/kg/d)。連續(xù)給藥2周。
　　結(jié)果:(1)丹參注射液的主要活性成分及其含量分別是丹參素(2.

9、15mg/mL)、原兒茶醛(0.44 mg/mL)和丹酚酸B(1.01 mg/mL)。(2)H&E染色結(jié)果表明，丹參注射液可明顯改善鐵超載所致的心臟損傷;(3)普魯士藍(lán)染色及組織鐵含量測定的結(jié)果顯示，丹參注射液可以顯著降低鐵在心臟的沉積;(4)血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，鐵超載模型組的CK、CK-MB及LDH水平明顯升高，丹參高劑量組和低劑量組使其活性下調(diào)，并且具有劑量依賴性。(5)心肌組織氧化指標(biāo)測定結(jié)果顯示:丹參可明顯提高小鼠抗氧化能

10、力，丹參高劑量組和低劑量組的MDA濃度顯著降低，同時(shí)SOD和GSH-Px水平顯著升高，并且具有劑量依賴性。
　　結(jié)論:上述結(jié)果表明丹參注射液對鐵超載所致小鼠心臟損傷具有明顯的改善作用，機(jī)制與丹參可減少鐵在心臟過量沉積，抑制脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。
　　第二部分丹參注射液對鐵超載所致肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的:研究丹參注射液對鐵超載所致小鼠的肝臟損傷保護(hù)作用及機(jī)制
　　方法:分組及給藥方法同“第一部分”。

11、>　　結(jié)果:(1)體重和肝系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，鐵模型組的體重和肝系數(shù)明顯升高，丹參注射液可有效緩解體重和肝系數(shù)的上升，對肝臟具有一定的保護(hù)作用;(2)H&E染色結(jié)果表明，丹參注射液可明顯改善鐵超載所致的肝臟損傷;(3)普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，丹參注射液可以顯著降低鐵在肝臟的沉積;(4)血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，鐵模型組的AST和ALT水平明顯降低，丹參高劑量組和低劑量組使其活性均有所上調(diào)，并且具有劑量依賴性;(5)肝臟組織氧化指標(biāo)測定結(jié)果顯

12、示:丹參可明顯提高小鼠抗氧化能力，丹參高劑量組和低劑量組的MDA濃度顯著降低，同時(shí)SOD和GSH-Px水平顯著升高，并且具有劑量依賴性;(6) TUNEL染色結(jié)果顯示，丹參注射液可顯著降低肝細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:上述結(jié)果表明丹參對鐵超載所致小鼠肝臟損傷具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制與丹參注射液可以減少鐵在肝臟的沉積，抑制脂質(zhì)過氧化和降低細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第三部分丹參注射液對心肌細(xì)胞鈣電流及鈣瞬變的作用
　　目的:研究丹參

13、注射液對心肌細(xì)胞膜L-型鈣電流（ICa-L）及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　方法:采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究丹參對大鼠心肌細(xì)胞膜ICa-L的作用;采用細(xì)胞收縮與離子濃度同步測量系統(tǒng)研究丹參注射液對心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及對心肌細(xì)胞收縮力的影響。
　　結(jié)果:(1)100μM維拉帕米可完全阻斷所記錄的電流，說明此電流即為ICa-L。(2)100mg/L丹參注射液可顯著抑制心肌ICa-L并且沖洗后可恢復(fù)至給藥前水平，說明該抑制作用

14、確由丹參注射液引起而非其自身的衰減。(3)丹參注射液可濃度依賴性降低ICa-L。量效曲線結(jié)果顯示，不同濃度的丹參注射液（0.1、0.3、1、3及10 g/L），對ICa-L的抑制率分別為11.6％、19.1％、26.7％、32.1％及35.2％。(4)丹參注射液對I-V關(guān)系及反轉(zhuǎn)ICa,L電位無明顯作用。(5)丹參注射液對心肌鈣離子激活和失活無明顯作用。(6)丹參注射液(3 g/L)可以顯著抑制心肌細(xì)胞收縮（抑制率為21.0％）和降低細(xì)

15、胞內(nèi)鈣離子濃度（鈣瞬變的峰值降低23.3％）。(7)丹參注射液可明顯的縮短從心肌細(xì)胞舒張開始至達(dá)到90％基線所需的時(shí)間(the timeto90％ of the baseline，Tr)，但對從收縮開始至到達(dá)收縮峰值10％的時(shí)間(the time to10％ of the peak，Tp)無影響。
　　結(jié)論:結(jié)果表明丹參注射液可明顯地抑制心肌細(xì)胞ICa-L，降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減弱心肌收縮力，發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。由于鐵離子可