丹參注射液對(duì)鐵超載斑馬魚(yú)的保護(hù)作用及對(duì)慢性鐵超載小鼠肝臟和心臟纖維化抑制作用與機(jī)制的研究.pdf

1、鐵是生物體所必需的微量元素，但同時(shí)也具有潛在毒性。持續(xù)性鐵超載引發(fā)的肝纖維化和心肌纖維化是導(dǎo)致鐵超載病人發(fā)病和死亡的主要原因。目前，對(duì)于鐵超載誘導(dǎo)的纖維化尚無(wú)有效的療法。
　　去鐵胺(Deferoxamine，DFO)為傳統(tǒng)的鐵鰲合劑，目前臨床上普遍采用的驅(qū)鐵治療藥。但DFO必須經(jīng)靜脈或體腔途徑給藥，從而導(dǎo)致病人依從性差，且會(huì)產(chǎn)生很多不良反應(yīng)。有大量報(bào)道證實(shí)，DFO對(duì)合并纖維化的鐵超載病人無(wú)顯著療效。最新研究表明，鈣通道是鐵進(jìn)入細(xì)

2、胞的主要途徑，鈣通道阻滯劑能有效地阻斷鐵進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并減少膠原組織蓄積。
　　中藥丹參(Salvia miltiorrhiza，SM)為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血祛瘀的功效，還具有抗纖維化、抗氧化、抗炎和抗凋亡等多靶點(diǎn)藥理作用。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，丹參對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用很可能與其阻斷細(xì)胞膜上的鈣通道減少鈣內(nèi)流密切相關(guān)。已有研究表明，丹參能夠逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化。
　　綜上所述，我們認(rèn)為在鐵超載的狀態(tài)下丹參很可能對(duì)臟器

3、具有保護(hù)作用。本研究論文利用分子生物學(xué)、病理形態(tài)學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法和手段，系統(tǒng)并深入地探討了以下內(nèi)容:(1)丹參注射液對(duì)鐵超載斑馬魚(yú)保護(hù)作用;(2)丹參注射液對(duì)鐵超載小鼠肝纖維化以及(3)心肌纖維化的防治作用。論文具體內(nèi)容從以下幾部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 丹參注射液對(duì)鐵超載斑馬魚(yú)保護(hù)作用
　　目的:以斑馬魚(yú)為受試動(dòng)物，研究丹參注射劑對(duì)鐵超載所致斑馬魚(yú)器官損傷的保護(hù)作用。
　　方法:以硫酸亞鐵溶液制備斑馬魚(yú)急性水浴染毒模型

4、，計(jì)算不同時(shí)間鐵超載致斑馬魚(yú)急性中毒的半數(shù)致死濃度LC50。將80條斑馬魚(yú)隨機(jī)分為正常組、鐵超載組、0.96 g/L丹參組、1.28 g/L丹參組、1.60 g/L丹參組和1.92 g/L丹參組。取斑馬魚(yú)心臟和肝臟組織勻漿檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)以及丙二醛(MDA)含量的改變。
　　結(jié)果:鐵超載斑馬魚(yú)24h的LC50為1.54 g/L，48 h、72 h和96 h的LC50均為1.37 g/

5、L。分別加入丹參0.32 g/L、0.64 g/L、0.96 g/L、1.28 g/L、1.60 g/L和1.92 g/L在1.00 g/L的鐵溶液中，斑馬魚(yú)24 h存活率分別被為0％，20％，50％，100％，100％和100％，96 h存活率則分別被為0％、0％、30％、50％、90％和100％。丹參各濃度組的肝臟和心臟的SOD活性、GSH含量顯著高于鐵超載組（P＜0.5），而MDA含量顯著低于鐵超載組(P＜0.5)。
　　結(jié)

6、論:丹參注射液能夠有效防治鐵超載所致斑馬魚(yú)心臟和肝臟的氧化應(yīng)激性損傷，并且丹參注射液的作用呈劑量依賴(lài)性。
　　第二部分 丹參對(duì)鐵超載小鼠肝纖維化的多靶點(diǎn)抑制作用的研究
　　目的:以鐵超載誘發(fā)肝纖維化的小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究丹參對(duì)鐵超載性肝纖維化的抑制作用及其潛在機(jī)制。
　　方法:將60只雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只:正常組(CONT，生理鹽水)、慢性鐵超載組(CIO，右旋糖酐鐵50 mg/kg/day)、低劑量丹參組

7、(L-SM，3g/kg/day)、高劑量丹參組(H-SM，6g/kg/day)以及去鐵胺組(DFO，100 mg/kg/day)。各組給藥方式均采用腹腔注射，L-SM組、H-SM組和DFO組在藥物治療4h前給予右旋糖酐鐵50 mg/kg/day，連續(xù)給藥7周。丹參注射液的主要成分通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行量化分析。采用常規(guī)方法對(duì)肝臟內(nèi)鐵分布、羥基脯氨酸(Hyp)含量、SOD活性、GSH以及MDA含量的進(jìn)行檢測(cè)。Ⅲ型膠原和腫瘤壞死因子-α(T

8、NF-α)的蛋白表達(dá)水平通過(guò)免疫組織化學(xué)法進(jìn)行分析檢測(cè)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)。肝臟的形態(tài)學(xué)變化采用石蠟切片通過(guò)蘇木精伊紅染色法(H&E)、普魯士藍(lán)染色和馬松三色法進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:(1)利用高效液相色譜法分析，丹參注射液被檢測(cè)到包含3種主要成分:丹參素、原兒茶醛以及丹酚酸B，其濃度分

9、別為2.15 mg/ml，0.44 mg/ml和1.01 mg/ml。(2) L-SM組以及H-SM組的肝臟系數(shù)與CIO組相比分別下降了28.30％和40.81％(P＜0.01)。(3)組織切片H&E染色觀察顯示，給與低劑量和高劑量丹參治療后，肝臟病變程度明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝內(nèi)血鐵黃素沉積、纖維組織和炎細(xì)胞明顯減少。(4)組織切片普魯士藍(lán)染色觀察顯示，與CIO組比較，L-SM組和H-SM組普魯士藍(lán)陽(yáng)性染色面積百分比分別減

10、少了約30.61％和53.86％(P＜0.01)。(5)組織切片馬松三色染色表明，經(jīng)低劑量和高劑量SM治療后，與CIO組比較，兩治療組小鼠肝纖維化的陽(yáng)性染色面積分別降低了約46.50％和89.29％(P＜0.01)。(6)與CIO組比較，L-SM組和H-SM組肝臟中Ⅲ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)面積明顯降低。(7)與CIO組比較，L-SM組和H-SM組肝臟Hyp含量分別降至0.14±0.01μg/mg和0.13±0.01μg/mg(P＜0.05和P

11、＜0.01)。(8)與CIO組比較，L-SM組和H-SM組TGF-β mRNA的表達(dá)水平分別降低了約23.32％和49.82％(P＜0.01)，而MMP-9 mRNA表達(dá)水平則分別增高了約1.1倍和3.4倍（P＜0.01）。(9) L-SM組和H-SM組的SOD活性和GSH含量與CIO組比較明顯升高，同時(shí)MDA水平顯著下降(P＜0.05和P＜0.01)。(10)與CIO組比較，L-SM組和H-SM組的致炎因子TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯減

12、弱。(11)與CIO組比較，L-SM組和H-SM組的caspase-3 mRNA表達(dá)水平分別降低了約18.25％(P＜0.05)和32.32％(P＜0.01)。
　　結(jié)論:丹參對(duì)慢性鐵超載性肝臟纖維化具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可歸因于丹參對(duì)肝內(nèi)鐵沉積、纖維增生、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的多靶點(diǎn)抑制作用。
　　第三部分 參注射液對(duì)鐵超載小鼠心肌纖維化抑制作用的研究
　　目的:本研究擬探討丹參注射液治療小鼠慢

13、性鐵超載性心肌纖維化的功效和基本機(jī)制。
　　方法:雄性昆明小鼠（8周齡）被隨機(jī)分成6組，每組10只:正常對(duì)照(CONT)組、慢性鐵超載組(CIO)、低劑量丹參(L-SM)組、高劑量丹參(H-SM)組、維拉帕米（VRP）組和去鐵胺(DFO)組。CONT組只注射等容量的生理鹽水。其他五組的小鼠，腹腔注射右旋糖酐鐵50mg/kg/day，持續(xù)7周，而后四組小鼠給鐵4h后還分別給予丹參3g/kg/day、丹參6 g/kg/day、維拉帕米

14、100 mg/kg/day和DFO100mg/kg/day。心臟組織切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色檢測(cè)鐵的沉積程度。心肌纖維化的程度由馬松三色染色和Hyp定量檢測(cè)確定。采用比色法測(cè)定心肌勻漿組織中SOD活性和MDA含量。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀測(cè)Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(COLⅢ)在心肌組織中的表達(dá)程度。應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)TGF-β1和MMP-9的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)L-SM組和H-SM組的心臟

15、系數(shù)與CIO組相比分別降低了16.08％和18.47％(P＜0.01)。(2)H&E切片染色觀察顯示，給與低劑量或高劑量丹參治療后，組織學(xué)變化水平顯著改善，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列規(guī)則和纖維組織減少。(3)心臟組織普魯士藍(lán)染色觀察顯示，與CIO組相比，L-SM組治療后鐵陽(yáng)性染色面積減少了約38.64％(P＜0.05)，H-SM組則減少了約65.91％(P＜0.01)。(4)組織切片馬松三色染色表明，與CIO組相比，L-SM組與H-SM組的心臟

16、組織纖維化面積與丹參給藥呈劑量依賴(lài)性，隨著給藥劑量的增加分別縮小約30.08％和64.37％(P＜0.01)。(5)經(jīng)過(guò)丹參治療后，L-SM組中Hyp含量降低至0.89±0.19μg/mg，H-SM組中Hyp含量降低至0.41±0.20μg/mg（與CIO組相比，P＜0.01）。(6)與CIO組相比，丹參治療可以明顯增強(qiáng)SOD活性并降低MDA濃度(P＜0.01)。(7)低劑量或高劑量丹參治療后COLⅠ蛋白陽(yáng)性表達(dá)程度明顯減弱，與CIO組