黃芪注射液對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化的保護(hù)作用.pdf

1、背景和目的:
　　 長(zhǎng)期腹膜透析可導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化綜合癥的發(fā)生,制約了腹膜透析的應(yīng)用和發(fā)展,其已成為困擾腹膜透析患者及其研究者的一個(gè)重要難題。因此,如何延緩甚至阻斷腹膜纖維化進(jìn)程,是本研究領(lǐng)域的一個(gè)重要熱點(diǎn)。
　　 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要組成成分之一。目前研究表明,腹膜間皮細(xì)胞能合成與分泌A(yíng)ngⅡ,腹膜局部產(chǎn)生的AngⅡ作為一

2、種重要的生長(zhǎng)因子,在調(diào)節(jié)腹膜間皮細(xì)胞的增殖、凋亡以及纖維化進(jìn)程中起重要作用。AngⅡ可以引起腹膜間皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF-β1)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogenactivator inhibitor-1,PAI-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mono

3、cyte chemoattractantprotein-1,MCP-1)等多種因子的表達(dá)異常。研究證實(shí),AngⅡ參與了腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 腹膜透析液的生物不相容因素,致腹膜間皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation,EMT),EMT是發(fā)生腹膜纖維化早期病變的關(guān)鍵,轉(zhuǎn)分化而來(lái)的肌纖維母細(xì)胞是參與腹

4、膜纖維化的主要細(xì)胞。有研究證實(shí),高糖環(huán)境導(dǎo)致腹膜發(fā)生氧化應(yīng)激促進(jìn)了EMT發(fā)生。細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚可能由兩方面因素引起:一是細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)多,二是細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少。細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶主要包括:絲氨酸蛋白酶類(lèi)(PA／PAI),基質(zhì)蛋白酶(MMPs／TIMP),其中PA是纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶系,是纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶的催化劑,PA的活性受PAI-1,2,3的調(diào)控,其中PAI-1最重要。
　　 活性氧(reactive oxyg

5、en species,ROS)是由氧激發(fā)的化學(xué)性質(zhì)十分活潑的分子,近年來(lái),其作為信號(hào)傳遞分子之一,在腹膜纖維化進(jìn)程中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。高糖腹膜透析液引起腹膜組織的氧化應(yīng)激已被認(rèn)為是導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的始動(dòng)因素。同時(shí),腹膜局部的血管緊張素Ⅱ也是引起腹膜氧化應(yīng)激反應(yīng)的最強(qiáng)刺激之一。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adeninedinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶是一種過(guò)氧化物酶,廣

6、泛存在于吞噬細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞,其催化產(chǎn)物ROS參與機(jī)體防御和信息傳遞等許多生理過(guò)程。NADPH氧化酶主要由5個(gè)亞基組成,包括:2個(gè)膜亞基gp91phox,P22phox；3個(gè)胞漿亞基P47phox,P40pox,P67phox。另外。還有2個(gè)低分子量的GTP結(jié)合蛋白R(shí)ap1A和rac2。當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激后,胞漿亞基P47phox被磷酸化激活,與P67phox結(jié)合并向胞膜轉(zhuǎn)位,與胞膜亞基結(jié)合組成有氧化活性的復(fù)合體,將氧催化為O2-,進(jìn)而

7、產(chǎn)生一系列活性氧,造成細(xì)胞損傷。NADPH氧化酶作為ROS的調(diào)控酶,其胞漿亞基p47phox在腹膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著始動(dòng)、樞紐性作用。色譜指紋圖譜證實(shí)黃芪注射液(astragalus intervention,AGI)有穩(wěn)定的清除自由基、抗氧化的色譜峰,超微結(jié)構(gòu)證實(shí)AGI能拮抗高糖環(huán)境對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。因此,從分子生物學(xué)角度探討AGI能否延緩腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展十分必要。
　　 本研究應(yīng)用AngⅡ刺激腹膜間皮細(xì)胞,

8、以探討AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox mRNA和蛋白表達(dá)的影響、及對(duì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)因子等表達(dá)的影響,及AGI干預(yù)作用,為腹膜纖維化防治提供新的思路。
　　 1 AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox表達(dá)的影響及AGI的干預(yù)作用
　　 1.1目的:
　　 探討AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞ROS和NADPH氧化酶亞基p47phox表達(dá)的影響,及二代腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)AGI

9、預(yù)處理后的干預(yù)作用。
　　 1.2方法:
　　 采用腹腔注射胰蛋白酶法,分離培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細(xì)胞(rat peritonealmesothelial cells,RPMCs),體外培養(yǎng)SD大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞至二代,靜止24h后,隨機(jī)分為:正常對(duì)照組)A組),AngⅡ(10-7mol／L)組(B組),AngⅡ+AGI(2g／ml)組(C組),AngⅡ+AGI(1g／m1)組(D組)。熒光染料(DCF)及激光共聚焦顯微鏡檢

10、測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。RT-PCR檢測(cè)NADPH氧化酶亞基p47phox的表達(dá)。Wester印跡檢測(cè)p47phox的蛋白表達(dá)。
　　 1.3結(jié)果:
　　 (1)AngⅡ可顯著增加大鼠腹膜間皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生,刺激20min后,ROS的表達(dá)較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)。AGI可顯著抑制AngⅡ刺激后ROS的產(chǎn)生,且AGI對(duì)ROS的抑制程度與AGI的濃度呈正相關(guān),B組、C組、D組三組比較差異顯著(P<0.05)；
　　

11、(2)RPMCs經(jīng)AngⅡ刺激后,NADPH氧化酶亞基p47phox mRNA和蛋白的表達(dá)均上升AGI可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p47phox表達(dá)上調(diào),C、D兩組分別與B組比較具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 1.4結(jié)論:
　　 AngⅡ可誘導(dǎo)RPMCs產(chǎn)生的ROS增加、NADPH氧化酶亞基p47phox表達(dá)上調(diào)。AGI制NADPH氧化酶的表達(dá)和活性及ROS的產(chǎn)生。
　　 2 AngⅡ誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及

12、AGI的干預(yù)作用
　　 2.1目的:
　　 探討AngⅡ誘導(dǎo)RPMCs轉(zhuǎn)分化,及二代腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)AGI預(yù)處理后的干預(yù)作用。
　　 2.2方法:
　　 體外培養(yǎng)SD大鼠原代RPMCs至二代,靜止24h后,隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組,AngⅡ(10-7mol／L)組,AngⅡ+AGI(2g／mL)組和AngⅡ+AGI(1g／mL)組。AngⅡ(10-7mol／L)組給予AngⅡ(10-7mol／L)體外刺激R

13、PMCs。AngⅡ+AGI(2g／mL)組和AngⅡ+AGI(1g／mL)組分別用AGI(2g／ml)、AGI(1g／ml)預(yù)處理1h后,再行AngⅡ(10-7mol／L)體外刺激RPMCs。實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定α-SMA、E-Cadherin mRNA的表達(dá):Western印跡法測(cè)定α-SMA、E-Cadherinm蛋白的表達(dá)?；虮磉_(dá)在8h,蛋白表達(dá)在24h分別觀(guān)察以上各組基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　 2.3結(jié)果:

14、r>　　 (1)AngⅡ可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志因子α—SMA mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào),二者均P<0.05。經(jīng)AGI預(yù)處理后可抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)上調(diào),使α-SMA mRNA和蛋白水平均降低,二者均P<0.05,未觀(guān)察到AGI對(duì)α-SMA mRNA和蛋白水平的抑制程度與AGI的濃度呈正相關(guān)。
　　 (2)AngⅡ可誘導(dǎo)E-Cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào),AGI可以顯著逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(P<0.05)。亦未觀(guān)察到AGI對(duì)E-Cadherin mRNA表達(dá)的影響與AGI的濃度有關(guān)。
　　 2.4結(jié)論;
　　 黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程有抑制作用。
　　 3 AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)的影響以及AGI的干預(yù)作用
　　 3.1目的:
　　 探討AngⅡ?qū)PMCs纖溶酶原激活物抑制物PAI-1表達(dá)的影響,及二代腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)AGI預(yù)處理后的干預(yù)作用。

16、>　　 3.2方法:
　　 采用腹腔注射胰蛋白酶法,分離培養(yǎng)RPMCs,體外培養(yǎng)SD大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞至二代,靜止24h后,隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(A組),AngⅡ(10-7mol／L)組(B組),AngⅡ+AGI(2g／ml)組(C組)AngⅡ+AGI(1g／ml)組(D組)。B組:用AngⅡ(10-7M)體外刺激RPMCs,檢測(cè)0,2h,4h,8h,12h,24h基因水平的變化。C組和D組:分別用AGI(2g／ml)、AG

17、I(1g／ml)預(yù)處理后,再行AngⅡ(10-7M)體外刺激RPMCs,基因水平在8h,蛋白水平在24h觀(guān)察以上各組各指標(biāo)的變化情況。
　　 3.3結(jié)果:
　　 (1)AngⅡ以時(shí)間依賴(lài)方式誘導(dǎo)PAI—1 mRNA表達(dá)上調(diào),從2h開(kāi)始,持續(xù)至12h,以4h為高峰,為0h的3.51±0.18倍(P<0.05),AngⅡ可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1蛋白表達(dá)上調(diào),以24h為高峰,為0h的1.69±0.16倍(P<0.05)。

18、
　　 (2)4h時(shí)AGI使PAI-1的mRNA下降了39.43％(C組),37.28％(D組),差異顯著(P<0.05)；24h時(shí)AGI使PAI-1的蛋白水平下降了29.41％(C組),24.12％(D組),差異顯著(P<0.05)。未觀(guān)察到AGI對(duì)PAI-1的mRNA和蛋白的抑制程度依賴(lài)于A(yíng)GI濃度,即C組與D組比較(P>0.05)。
　　 3.4結(jié)論:
　　 AGI通過(guò)抑制PAI-1的表達(dá),減少腹膜間皮細(xì)胞

19、外基質(zhì)的過(guò)度積聚來(lái)延緩腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
　　 4 AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞TGF—β1表達(dá)的影響以及AGI的干預(yù)作用
　　 4.1目的:
　　 觀(guān)察AngⅡ?qū)PMCs轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF—β1表達(dá)的影響,及二代腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)AGI預(yù)處理后的干預(yù)作用。
　　 4.2方法:
　　 取第2代RPMC(經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和免疫組化鑒定),隨機(jī)分為4組,A組即對(duì)照組:DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；B組:DMEM

20、／F12培養(yǎng)基中加入AngⅡ(10-7mol／L)組；C組:DMEM／F12培養(yǎng)基中加入AngⅡ(10-7mol／L)+AGI(2g／ml)組:D組:DMEM／F12培養(yǎng)基中加入AngⅡ(10-7mol／L)+AGI(1g／ml)組。培養(yǎng)24h收集細(xì)胞提取RNA,48h收集細(xì)胞提取蛋白,RT-PCR檢測(cè)腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)。Western印跡檢測(cè)TGF-β1的蛋白表達(dá)。
　　 4.3結(jié)果:
　　 (1)

21、RPMCs經(jīng)AngⅡ(10-7mol／L)后,TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)均上升,與0h比較,TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)分別于24h、48h時(shí)達(dá)到高峰,A、B兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (2)AGI可顯著抑制AngⅡ(10-7mol／L)刺激腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào),24h時(shí),AGI使TGF-β1 mRNA的表達(dá)下降明顯,B組分別為:A組的2.50倍、C組的2.12倍

22、、D組的1.68倍,D組為C組的1.25倍。48h時(shí),AGI使TGF-β1的蛋白水平下降明顯,B組分別為:A組的1.85倍、C組的1.51倍、D組的1.24倍,D組為C組的1.22倍。C、D兩組分別與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且抑制程度:與AGI濃度呈正相關(guān),即C、D兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.4結(jié)論
　　 AGI抑制腹膜纖維化的中樞性因子TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)的活性是

23、其延緩腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展重要機(jī)制之一。
　　 5 AngⅡ?qū)Ω鼓らg皮細(xì)胞MCP-1達(dá)的影響及AGI的干預(yù)作用
　　 5.1目的:
　　 觀(guān)察AngⅡ?qū)PMCs單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA和蛋白表達(dá)的影響,及二代腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)AGI預(yù)處理后的干預(yù)作用。
　　 5.2方法;
　　 采用腹腔注射胰蛋白酶法,分離培養(yǎng)RPMCs,體外培養(yǎng)SD大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞至二代,靜止24h后,隨機(jī)分為

24、:正常對(duì)照組(A組),AngⅡ(10-7mol／L)組(B組),AngⅡ+AGI(2g／ml)組(C組),AngⅡ+AGI(1g／ml)組(D組)。B組:用AngⅡ(10-7M)體外刺激RPMCs,RT-PCR法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)MCP-1 mRNA的表達(dá)； Western blot法檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)MCP-1的蛋白表達(dá)。
　　 5.3結(jié)果;
　　 (1)AngⅡ刺激RPMCs,4小時(shí)后可誘導(dǎo)MOP-1 mRNA的表達(dá)上調(diào)

25、,AGI預(yù)處理可顯著抑制這種上調(diào),與AngⅡ組相比,AGI低濃度組和高濃度組分別使MCP-1 mRNA表達(dá)降低了15.6％和49.9％(P<0.05),而且對(duì)MCP-1 mRNA表達(dá)的抑制程度與其濃度呈正相關(guān),4組與3組比較(P<0.05)。
　　 (2)AngⅡ刺激RPMCs,8小時(shí)后可誘導(dǎo)MCP—1蛋白的表達(dá)上調(diào),黃芪預(yù)處理可顯著抑制這種上調(diào),與AngⅡ組相比,AGI低濃度組和高濃度組分別使MCP-1蛋白表達(dá)降低了17.6％

26、和43.7％(P<0.05),而且對(duì)MCP-1蛋白表達(dá)的抑制程度與其濃度呈正相關(guān),即4組與3組比較(P<0.05)。
　　 5.4結(jié)論;
　　 AGI延緩腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的臨床作用,與其抑制腹膜間皮細(xì)胞中MCP—1基因及蛋白的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。
　　 總結(jié):
　　 (1)AngⅡ可誘導(dǎo)RPMCs ROS產(chǎn)生增加以及NADPH氧化酶亞基p47phox的表達(dá)升高,AGI可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的RPMCs ROS

27、產(chǎn)生增加及NADPH氧化酶亞基p47phox的表達(dá)升高,該實(shí)驗(yàn)提示AGI可減輕由AngⅡ誘導(dǎo)的RPMCs氧化應(yīng)激損傷。
　　 (2)AngⅡ可誘導(dǎo)RPMCsα-SMA、PAI-1、TGF-β1、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)及E-Cadherin mRNA表達(dá)下調(diào),AGI可顯著抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的RPMCsα-SMA、PAI—1、TGF-β1、MCP—1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)及E—Cadherin mRNA表達(dá)下調(diào),這些因

28、子與腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)積聚的發(fā)生關(guān)系密切,該實(shí)驗(yàn)提示AGI可通過(guò)抑制以上因子表達(dá)的異常,阻斷或延緩腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)積聚的發(fā)生,從而延緩腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 (1)目前,雖然經(jīng)色譜指紋圖譜證實(shí)AGI有穩(wěn)定的清除自由基、抗氧化的色譜峰,但在腹膜組織中,AGI清除自由基、抗氧化作用與NADPH氧化酶亞基p47phox、ROS之間的對(duì)話(huà)如何?還沒(méi)見(jiàn)報(bào)道,該研究提示AGI可通過(guò)下

29、調(diào)p47phox的表達(dá)、減少ROS的產(chǎn)生,從而減輕RPMCs氧化應(yīng)激損傷。
　　 (2)雖然AGI與RPMCs TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)之間對(duì)話(huà)的研究已有報(bào)道,但AGI與RPMCsα-SMA、PAI-1、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)及E-CadherinmRNA表達(dá)之間對(duì)話(huà)的研究罕有報(bào)道。該研究表明:通過(guò)AGI干預(yù)后,AGI可阻止腹膜間皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；并通過(guò)加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解、減輕炎癥反應(yīng),從而減少細(xì)胞外基質(zhì)