NADPH氧化酶在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化中的作用研究.pdf

1、腹膜透析是終末期腎功能衰竭患者的主要腎臟替代療法。腹膜纖維化是長期腹膜透析患者的主要并發(fā)癥，最終會導(dǎo)致超濾功能的喪失以致退出腹膜透析。腹膜透析液的生物不相容性被認(rèn)為是導(dǎo)致超濾失敗和腹膜纖維化的主要原因。然而，目前為止，腹膜纖維化發(fā)生的具體機(jī)制仍不十分清楚，而且防治的措施也較為有限，因此探討腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制，并尋求更為有效的治療方法，將具有重要的臨床意義。 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的重要組成成

2、分。目前認(rèn)為，局部產(chǎn)生的Ang Ⅱ作為一種重要的生長因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，凋亡以及纖維化進(jìn)程。血管緊張素Ⅱ可以引起細(xì)胞外基質(zhì)的積聚以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。同時(shí)，AngⅡ促進(jìn)多種炎癥因子的分泌，參與了AngⅡ引起的靶器官損傷過程。越來越多的證據(jù)表明，血管緊張素Ⅱ與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不十分明確。 近年來，活性氧(ROS)作為信號傳遞分子，在腹膜透析領(lǐng)域的作用正受到越來越多的關(guān)注。高糖腹膜透析液引起的氧化應(yīng)激已被認(rèn)

3、為是導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的主要因素之一。同時(shí)，血管緊張素Ⅱ也是引起氧化應(yīng)激的最強(qiáng)刺激之一。因此我們推測，ROS可能參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腹膜結(jié)構(gòu)及功能的改變。NADPH氧化酶是ROS的主要調(diào)控酶，其胞漿成分p47phox，p67phox和胞膜成分p22phox，gp91phox是NADPH氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵亞基。關(guān)于此酶及其各個亞基的結(jié)構(gòu)和功能目前國內(nèi)外已有相當(dāng)多的研究，但大都集中在心血管系統(tǒng)，而腹膜間皮細(xì)胞中該酶的具體功能國內(nèi)外

4、報(bào)道則很少，鑒于此，我們著眼于NADPH氧化酶在腹膜纖維化進(jìn)展中的作用進(jìn)行研究，從而為腹膜纖維化的防治開辟一條新途徑。本研究應(yīng)用Ang ⅡⅠ型受體(AT1)拮抗劑洛沙坦(Losartan)和NADPH氧化酶抑制劑DPI來觀察對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞(RPMCs)ROS產(chǎn)生以及NADPH氧化酶表達(dá)的影響，并進(jìn)一步觀察對下游效應(yīng)包括炎癥因子的表達(dá)，RPMCs轉(zhuǎn)分化以及細(xì)胞外基質(zhì)積聚三方面的作用，以探討NADPH氧化酶依賴的ROS是

5、否介導(dǎo)了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展及其可能機(jī)制。 一、研究目的 探討NADPH氧化酶在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化中的作用。 二、研究內(nèi)容 1．觀察大鼠腹膜間皮細(xì)胞中Ang Ⅱ誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和NADPH氧化酶的表達(dá)情況，以及Ang Ⅱ?qū)ρ装Y因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的影響。 2．探討NADPH氧化酶在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化中的作用。 3．探討AT1受體是否介導(dǎo)了A

6、ngⅡ誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化。 三、材料和方法1．細(xì)胞培養(yǎng)及分組采用胰酶消化法分離SD雄性大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)至第二代，并常規(guī)鑒定。將細(xì)胞靜止24小時(shí)使其同步化后，加入AngⅡ(10<'-7>M)孵育，部分實(shí)驗(yàn)組中應(yīng)用AngⅡⅠ型受體拮抗劑Losartan(10<'-5>M)或NADPH氧化酶活性抑制劑DPI(10<'-5>M)提前孵育1小時(shí)進(jìn)行干預(yù)處理。 2．檢測方法 應(yīng)用熒光染料(DCF)及激光共聚焦

7、顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。RT-PCR檢測NADPH氧化酶亞單位p47phox，p67phox，p22phox，gp91phox以及PAI-l、α-SMA、E-cadherin、MCP-1、IL-6 mRNA的表達(dá)。Western blot檢測p47phox、α-SMA、PAI-1、COL-1的蛋白表達(dá)。 3．結(jié)果分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算機(jī)密度分析采用單位面積計(jì)算機(jī)圖像掃描值減去背景值的均值表示信號強(qiáng)度，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算兩者

8、吸光度的比值，并以對照組作為基準(zhǔn)，計(jì)算其它各實(shí)驗(yàn)組相對吸光度值，以x±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本凇驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、結(jié)果 1．RPMCs的培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)的RPMCs呈多邊形，菱形，橢圓形，大小不等。細(xì)胞融合后，呈典型的鵝卵石狀或鋪路石樣上皮細(xì)胞形態(tài)。免疫組化結(jié)果示細(xì)胞角蛋白陽性。 2．AngⅡ?qū)OS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達(dá)的影響以及DPI和Losartan的干預(yù)作用2.1

9、AngⅡI對ROS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達(dá)的影響Ang Ⅱ刺激RPMCs后可顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，15 min時(shí)是對照組的3.64±0.53倍(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可誘導(dǎo)NADPH氧化酶亞單位p47phox，p22phox，gp91phox mRNA的表達(dá)上升，p67phox的表達(dá)雖有上升趨勢，但與0 h相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導(dǎo)p47phox蛋白表

10、達(dá)上調(diào)，以48 h為高峰(P<0.05)。 2.2 DPI和Losartan對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達(dá)的干預(yù)作用Ang Ⅱ刺激RPMCs 15 min后可顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，DPI和Losartan預(yù)處理可明顯減少由AngⅡ誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生增加，與AngⅡ組相比，使ROS分別下降了86.8﹪和77.4﹪(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，Losartan和DPI預(yù)處理可阻斷由Ang

11、Ⅱ誘導(dǎo)的p47phox和gp91phox mRNA表達(dá)的上調(diào)。但是DPI卻顯著刺激了p67phox的上調(diào)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 3．Ang Ⅱ?qū)ρ装Y因子產(chǎn)生的影響以及DPI和Losartan的干預(yù)作用AngⅡ刺激RPMCs 8小時(shí)后可誘導(dǎo)MCP-1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，Losartan和DPI預(yù)處理可阻斷這種上調(diào)，使其分別降低了13.7﹪和53.6﹪(P<0.05)。AngⅡ顯著增加了IL-6 mRNA的表達(dá)，是正常對照組的1

12、.50±0.19倍，Losartan可抑制其表達(dá)上調(diào)，使其下降了33.4﹪(P<0.05)，但DPI卻明顯刺激了IL-6的表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 4．Ang Ⅱ誘導(dǎo)RPMCs轉(zhuǎn)分化以及DPI和Losartan的干預(yù)作用4.1 AngⅡ誘導(dǎo)RPMCs轉(zhuǎn)分化AngⅡ誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化標(biāo)志α-SMA表達(dá)上調(diào)，其mRNA水平從2 h開始增加，4 h達(dá)高峰，為0 h組的1.84+0.19倍(P<0.05)，增高持續(xù)至12 h

13、。Westernblot結(jié)果也顯示，AngⅡ可明顯增加α-SMA蛋白水平的表達(dá)，隨時(shí)間逐漸增加，72 h達(dá)最高。AngⅡ可誘導(dǎo)E-Cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào)，以12 h和24 h為著，24 h下降至0 h的59.3﹪(P<0.05)。 4.2 DPI和Losartan對AngⅡ誘導(dǎo)的RPMCs轉(zhuǎn)分化的影響Losartan預(yù)處理后可以阻斷由AngⅡ誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)上調(diào)，使α-SMAmRNA和蛋白水平降低，相比AngⅡ

14、組分別下降了25.4﹪和50.0﹪(P<0.05)。DPI也可以阻斷由AngⅡ誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)上調(diào)，與AngⅡ組相比，分別降低了其mRNA和蛋白水平的45.4﹪和56.1﹪(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導(dǎo)E-Cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào)，Losartan和DPI可以明顯逆轉(zhuǎn)這種表達(dá)的下調(diào)，使其表達(dá)比AngⅡ組上升了63.8﹪和49.1﹪，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 5．Ang Ⅱ?qū)?xì)胞外

15、基質(zhì)積聚的影響以及DPI和Losartan的干預(yù)作用5.1 Ang Ⅱ?qū)?xì)胞外基質(zhì)積聚的影響RT-PCR結(jié)果顯示，AngⅡ以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)PAI-1的mRNA表達(dá)上調(diào)，從2 h開始，持續(xù)至24 h，以8 h為高峰，為0 h組的3.50±0.56倍(P<0.05)。Western blot結(jié)果也顯示，AngⅡ刺激RPMCs 24小時(shí)后可上調(diào)PAI-1及COL-1的蛋白表達(dá)水平，分別為對照組的1.64±0.25和1.28±0.09倍(P<

16、0.05)。 5.2 DPI和Losartan對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)積聚的干預(yù)作用AngⅡ誘導(dǎo)RPMCs PAI-1的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，Losartan和DPI可顯著降低PAI-1的表達(dá)水平(P<0.05)。AngⅡ刺激RPMCs 24小時(shí)后可上調(diào)COL-1的蛋白表達(dá)水平，與刺激組相比，DPI可明顯阻斷這種上調(diào)，使其降低了71.9﹪(P<0.05)，而Losartan預(yù)處理則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 五、結(jié)論