肝纖維化過(guò)程中血管緊張素原表達(dá)及作用研究.pdf

1、背景和目的：肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell HSC)活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，是各種致肝纖維化因素作用的靶細(xì)胞和共同通道。組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system RAS)在組織纖維化形成中具有重要作用。肝臟中亦有組織RAS，并參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。血管緊張素原(angiotensinogen AGT)是RAS的基礎(chǔ)物質(zhì)，為深入了解AGT在肝纖維化中對(duì)HSC

2、的作用，本文動(dòng)態(tài)觀察四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化過(guò)程中AGT的表達(dá)及細(xì)胞來(lái)源，構(gòu)建針對(duì)AGT的短發(fā)卡狀RNA(short hairpin RNA shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體和AGT增強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒載體，觀察AGT對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)、Ⅰ、Ⅲ型前膠原和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1 TGF-β1)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloprote

3、inase-1 TIMP-1)等表達(dá)和/或合成的作用。為了提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，制備新型納米基因載體(poly(ethyleneimine)biscarbamate conjugate PEIC)，進(jìn)行表征，體外轉(zhuǎn)染HSC-T6，探討該納米顆粒最佳的轉(zhuǎn)染效率。
　　 方法：
　　 1.四氯化碳誘導(dǎo)SD大鼠建立肝纖維化動(dòng)物模型。肝纖維化過(guò)程檢測(cè)AGT和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin SMA活化肝星

4、狀細(xì)胞標(biāo)志)表達(dá)。
　　 2.設(shè)計(jì)并合成4個(gè)小分子RNA(siRNA)序列，構(gòu)建靶向AGTshRNA質(zhì)粒表達(dá)載體、鑒定。與AGT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，western blot外源篩靶，篩選出一對(duì)有效靶點(diǎn)。
　　 3.AGTshRNA質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HSC-T6，另設(shè)空質(zhì)粒組、AGT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組，G418篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。Realtime PCR檢測(cè)各組A

5、GT、α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)前膠原、TGF-β1、TIMP-1mRNA表達(dá)。Western blot檢測(cè)AGT蛋白表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay ELISA)測(cè)定血管緊張素Ⅰ、Ⅱ、TGF-β1、Ⅰ型膠原含量。放射免疫法測(cè)定Ⅲ型膠原含量。
　　 4.選用PEIC納米粒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，通過(guò)粒徑分析儀和掃描電子顯微鏡證實(shí)納米粒平均粒徑，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)納米載體與DNA結(jié)合能力

6、及抗核酸酶的降解能力，MTT法測(cè)定其細(xì)胞毒性。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP表達(dá)的陽(yáng)性效率及測(cè)定熒光素酶活性，評(píng)價(jià)相同條件下該納米基因載體與PEI(25KD)及商業(yè)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine2000、Fugene6)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：
　　 1.建立大鼠肝纖維化模型，QRT-PCR顯示肝纖維化早期AGT逐漸增加，肝纖維化晚期表達(dá)下降，與SMAmRNA的表達(dá)有相關(guān)性。免疫組化染色確定AG

7、T表達(dá)的細(xì)胞來(lái)源。
　　 2.構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體完全符合設(shè)計(jì)要求，篩選出一對(duì)有效靶點(diǎn)。
　　 3.與空質(zhì)粒組相比，AGTshRNA質(zhì)粒組明顯抑制AGT、α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)前膠原、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表達(dá)，抑制AGT蛋白水平的表達(dá)，降低上清液中血管緊張素Ⅰ、Ⅱ，Ⅰ型膠原、Ⅲ型前膠原、TGF-β1的含量(P<0.01或P<0.05)。而AGT過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組明顯上調(diào)AGT、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、T

8、GF-β1mRNA的表達(dá)，上調(diào)AGT蛋白水平的表達(dá)，增加上清液中血管緊張素Ⅰ、Ⅱ，Ⅰ型膠原、Ⅲ型前膠原、TGF-β1的含量(P<0.01或P<0.05)。
　　 4.PEIC/DNA質(zhì)量比1:1至15:1，形成穩(wěn)定復(fù)合物，復(fù)合物粒徑范圍為153-247nm，zeta電位則從-1.18mv增加到22.86mV，PEIC能有效保護(hù)DNA不受核酸酶Ⅰ降解，復(fù)合物的毒性隨質(zhì)量比增加；復(fù)合物在質(zhì)量比7:1時(shí)對(duì)HSC-T6細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到最高

9、，其效果高于PEI(25KD)、Lipofectamine2000和Fugene6。
　　 結(jié)論：
　　 1.肝纖維化早期AGTmRNA隨病理分期表達(dá)增加，肝纖維化晚期表達(dá)減少。肝纖維化過(guò)程激活的肝星狀細(xì)胞可合成AGT。
　　 2.成功構(gòu)建編碼AGTshRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染。
　　 3.AGT的量變可明顯影響肝星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、TGF-β1基因表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌。