Delta--like配體4在肝纖維化過(guò)程中的機(jī)制研究.pdf

1、在人類中，Notch信號(hào)通路有五個(gè)配體(Jagged1，Jagged2，Delta-like配體1(Dll1)，Dll3和Dll4）。Notch受體和配體在各種人體組織里都有表達(dá)，其中也包括肝臟組織。Alagille綜合征是一種小葉間膽管發(fā)育不良的累及多系統(tǒng)的顯性遺傳性疾病，Jagged1基因突變被證實(shí)是導(dǎo)致Alagille綜合征的病因。但是有趣的是，Alagille綜合征患者不會(huì)發(fā)展成明顯的纖維化。此外，在病變肝臟的新生小血管和膽管中

2、發(fā)現(xiàn)Jagged1和Notch3過(guò)表達(dá)，例如原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliarycirrhosis，PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）。這些研究表明，Notch信號(hào)通路可能通過(guò)參與新生異常血管和膽道反應(yīng)，與門(mén)脈周圍纖維化過(guò)程相關(guān)。然而，Notch配體在肝纖維化進(jìn)展中的作用仍不清晰。
　　第一部分 Notch信號(hào)通路在慢性HBV感染患者中的表達(dá)變化

3、>　　方法(1)為了探討Notch受體和配體的表達(dá)水平與肝纖維化形成機(jī)制的關(guān)聯(lián)性，采用免疫組化檢測(cè)10例HBV感染后肝硬化的肝組織和5例對(duì)照組的肝組織中的Notch配體（Jagged1，Jagged2，Dil1，Dll3和Dll4）和受體(Notch1，2，3和4)表達(dá)情況。在肝纖維化激活的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)和肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFBs)的關(guān)鍵機(jī)制中，需要進(jìn)一步

4、明確Notch受體和配體是否存在于激活的HSCs和MFBs中。通過(guò)雙染技術(shù)研究Notch受體/配體和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，激活的HSCs或者M(jìn)FBs標(biāo)記物）。(2)為了判斷Notch信號(hào)通路和肝臟疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，通過(guò)免疫組化顯示113例HBV感染患者的肝臟組織的Dll4和Notch1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果(1)免疫組化顯示在HBV感染后肝硬化的肝組織中Notch配體Jagged1，Dll3和Dll4以及受體Notc

5、h1，2，3和4呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，然而在對(duì)照組的肝組織中呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。在這些已知的Notch受體和配體中，Jagged1，Dll4和Notch1在肝竇細(xì)胞中呈陽(yáng)性染色。共聚焦顯微鏡顯示表明在肝硬化組織的激活的HSCs和MFBs中強(qiáng)烈表達(dá)Dll4和Notch1。(2)在非肝硬化的HBV感染患者中，Notch1染色陽(yáng)性主要集中在膽管上皮細(xì)胞。然而，有趣的是，僅有HBV感染的肝硬化患者，Notch1染色陽(yáng)性表達(dá)在肝竇細(xì)胞中。進(jìn)一步評(píng)估不同疾病

6、程度的HBV感染患者中肝竇細(xì)胞和匯管區(qū)的Notch1和Dll4的表達(dá)水平顯示，Dll4的免疫組化評(píng)分與炎癥分級(jí)(r=0.6，p＜0.0001)以及纖維化分級(jí)(r=0.68，p＜0.0001)呈顯著相關(guān)性。這些結(jié)果表明，在HBV慢性感染中，Dll4可能與炎癥和/或纖維化呈相關(guān)性。
　　結(jié)論(1)慢性HBV感染的肝硬化患者中，Notch配體Dll4和受體Notch1在激活的HSCs和MFBs中明顯表達(dá)。(2)在113例HBV感染患者中

7、，Dll4的免疫組化評(píng)分與炎癥分級(jí)以及纖維化分級(jí)呈顯著相關(guān)性。
　　第二部分 rDli4的體內(nèi)注射對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型的影響
　　方法將18只C57BL/6小鼠按照體重隨機(jī)分為3組（每組6只）:空白組、CCl4組和CCl4+rDll4組。在CCl4組，腹腔內(nèi)注射CCl4（0.5ml/kg，按1∶4稀釋于橄欖油中，每周注射兩次），連續(xù)4周。在CCl4+rDll4組，腹腔內(nèi)注射CCl4的同時(shí)，每周兩次注射6.25μg

8、的rDll4，連續(xù)4周。在空白組，腹腔內(nèi)僅注射與CCl4組同等劑量的橄欖油。在最后一次腹腔內(nèi)注射CCl4后，留取全血標(biāo)本并頸椎脫臼處死小鼠。
　　結(jié)果(1) rDll4的注射顯著的升高了肝臟Hes1和Hes5的mRNAs(Notch信號(hào)通路的直接的兩個(gè)靶基因)的表達(dá)水平，這表明在肝臟中Notch信號(hào)通路被rDll4激活。在rDll4治療后，CCl4誘導(dǎo)的小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平明顯下降。組織學(xué)上，rDll4治療后顯著降低

9、肝臟纖維化和肝臟中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞水平。與病理組織學(xué)結(jié)果一致，實(shí)時(shí)定量PCR顯示rDll4治療顯著降低CCl4誘導(dǎo)的肝臟膠原蛋白1α1和α-SMA的mRNA的表達(dá)水平。此外，rDll4治療后，CCl4誘導(dǎo)的羥脯氨酸含量也明顯下降。(2)除了纖維化相關(guān)指標(biāo)以外，進(jìn)一步評(píng)估rDll4對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥的影響。HE染色顯示rDll4治療顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR比較檢測(cè)rDll4治療與非治療CCl4誘導(dǎo)

10、的小鼠肝臟中一系列炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，包括TNF-α，IFN-γ，IL-1α，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12α，IL-13和TGF-β1。rDll4的治療顯著抑制了CCl4誘導(dǎo)的TNF-α，IL-6，IL-10和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平(p＜0.05），而對(duì)IL-1α和IL-12α的mRNA的表達(dá)水平并沒(méi)有明顯的影響(p＞0.05）。另外，兩組中IL-2，IL-4和IL-13的mRNA表達(dá)水平都非常低。接著，進(jìn)

11、一步探討rDll4對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。F4/80，S100A4和CD45分別是巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞的炎癥細(xì)胞的標(biāo)記物。免疫組化分析表明CCl4誘導(dǎo)的這三種炎癥細(xì)胞隨著rDll4的治療明顯下降。另外，rDll4的治療不能改變TGF-β1的mRNA的表達(dá)水平，但是，可以導(dǎo)致了p-Smad2表達(dá)水平的下降（TGF-β信號(hào)通路激活的標(biāo)記物）。這些結(jié)果表明rDll4可能直接通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型。

12、　　結(jié)論體內(nèi)注射rDll4蛋白可明顯改善四氯化碳誘導(dǎo)小鼠的肝損傷，炎癥和纖維化程度。
　　第三部分 rDll4處理培養(yǎng)的HSCs對(duì)其纖維化相關(guān)因子的影響
　　方法(1)通過(guò)使用GSI（一種Notch信號(hào)通路抑制劑），評(píng)估Notch信號(hào)通路在體外大鼠原代HSCs和纖維化貯脂細(xì)胞(cirrhotic fat storing cells，CFSCs)中的作用。另外，應(yīng)用Adeasy cloning系統(tǒng)(Quantum，Heidel

13、berg，Germany)獲得(CAGA)9-MLP-Luc的重組腺病毒，CFSCs高度增殖感染后，通過(guò)β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白標(biāo)記重組病毒進(jìn)行評(píng)估。一般的，90％以上的CFSCs被感染。24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，感染后將感染細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)血清但含0.5％ FCS的DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜和第二天進(jìn)行刺激。(2)接著，探討培養(yǎng)的HSCs和CFSCs中Dll4的影響。rDll4處理原代大鼠HSCs和CFSCs，進(jìn)一步檢測(cè)纖維化相關(guān)因子水平。另外，

14、在CFSCs中采用RNAi技術(shù)阻斷Dll4:轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種在24孔板上，0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70-90％;在50μL的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基加入20pmolsiRNA，柔和混勻;混勻SiMi Transfection Reagents試劑，用50μL無(wú)血清的DMEM稀釋1μL SiMi Transfection Reagents試劑，輕輕混勻，室溫

15、放置5分鐘;將稀釋好的siRNA和SiMi Transfection Reagents試劑混合;輕柔混勻，室溫放置20分鐘，以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents復(fù)合物;將100μL siRNA/SiMiTransfection Reagents復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板的孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板板;細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育24h-48h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其它檢測(cè)步驟。
　　結(jié)果(

16、1)在原代HSCs中GSI的處理降低了膠原蛋白Ⅰ的mRNA的基礎(chǔ)水平，也抑制了TGF-β介導(dǎo)的膠原蛋白Ⅰ的mRNA的上調(diào)。在CFSCs中，GSI的治療可以阻止TGF-β介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)，α-SMA和膠原蛋白1α1蛋白的上調(diào)。而且，GSI的處理顯示GSI對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的Ad(CAGA)9-MLPLuc受體基因激活的顯著抑制效果，這表明Notch信號(hào)通路的阻

17、斷可以影響經(jīng)典的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在GSI存在情況下，IL-13刺激α-SMA蛋白表達(dá)可以被完全阻斷。這些結(jié)果表明，Notch信號(hào)通路促進(jìn)HSCs中促纖維化基因的表達(dá)。(2) rDll4處理原代大鼠HSCs，發(fā)現(xiàn)可以抑制TGF-β誘導(dǎo)膠原蛋白1α1的mRNA的表達(dá)，但是無(wú)論在大鼠還是小鼠HSCs中不能影響α-SMA的mRNA的表達(dá)。在蛋白水平，在CFSCs中，rDll4的處理降低了TGF-β誘導(dǎo)的CTGF的表達(dá)，但是對(duì)α-SMA蛋白的