ATF4調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝纖維化中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　肝纖維化是肝臟在藥物、病毒或缺血再灌注等病因刺激下發(fā)生的一種可逆的損傷修復(fù)反應(yīng)，其特征在于肝損傷后引發(fā)的細(xì)胞外基質(zhì)的積累。肝纖維化是許多慢性肝臟疾病共同的病理基礎(chǔ)，持續(xù)進(jìn)展的肝纖維化最終可能會(huì)導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、門脈高壓甚至肝癌等，常常需要接受肝移植治療。慢性病毒性肝炎、毒素、藥物作用、膽汁淤積、營(yíng)養(yǎng)缺乏、酒精濫用導(dǎo)致的酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病均可能導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，但是具體的細(xì)胞生物學(xué)過程和潛在的分

2、子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，靶向其中關(guān)鍵的調(diào)控分子和干預(yù)靶標(biāo)，可為肝纖維化及其相關(guān)終末期肝病的防治提供新的思路和策略。
　　肝臟內(nèi)持續(xù)慢性炎癥微環(huán)境被認(rèn)為是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)生的重要原因之一。在藥物毒性、病毒感染等情況下，肝細(xì)胞死亡和代償性增殖反復(fù)出現(xiàn)，肝臟發(fā)生慢性炎癥，該過程中往往伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ER-Stress)。細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成加工與分泌，正常情況

3、下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保持著一定的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)細(xì)胞中的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白累積過多，超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力時(shí)就會(huì)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。促進(jìn)特定的蛋白合成以應(yīng)對(duì)應(yīng)激，同時(shí)減少一般的蛋白質(zhì)合成。既往研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中最主要的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)激活的三條主要的信號(hào)通路是IRE1(inositol-requiring enzyme1)，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和ATF6。通過UPR反應(yīng)，細(xì)胞經(jīng)

4、由自噬降解蛋白質(zhì)并清除未折疊蛋白，恢復(fù)平衡的穩(wěn)態(tài)。
　　ATF4（轉(zhuǎn)錄激活因子4）分子屬于ATF/CREB（轉(zhuǎn)錄激活因子/環(huán)一磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）家族，是一個(gè)堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈(bZip)轉(zhuǎn)錄因子，其入核后可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)UPR的基因表達(dá)來參與調(diào)控未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且其上游的eIF2α還能夠被除PERK之外的調(diào)控分子磷酸化激活，參與病毒感染、氨基酸缺乏、貧血等病理過程的調(diào)控;同時(shí)ATF4還廣泛參與包括惡性腫瘤在內(nèi)的

5、多種復(fù)雜疾病發(fā)病過程。所以ATF4及其調(diào)控的靶基因在肝纖維化和肝癌發(fā)生中的作用值得深入研究。本課題將會(huì)通過ATF4敲除小鼠模型，體外細(xì)胞模型和臨床肝癌樣本三個(gè)層面開展研究，積極探究ATF4及其下游分子在肝纖維化和肝癌發(fā)生中的動(dòng)態(tài)變化，旨在闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)信號(hào)通路在肝纖維化中的調(diào)控作用，評(píng)估ATF4作為肝癌預(yù)后判斷分子標(biāo)志物的價(jià)值。
　　在肝纖維化病理基礎(chǔ)上發(fā)展而來的肝癌是導(dǎo)致肝病患者死亡的主要原因之一。肝癌早期診斷率低，病情

6、進(jìn)展快，一般患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到晚期，晚期肝癌患者只有6個(gè)月的中位生存時(shí)間。肝細(xì)胞癌是一種預(yù)后極差的腫瘤，5年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)70％。雖然針對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展已有大量研究，但是由于肝癌的高度異質(zhì)性，現(xiàn)有的分型體系無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的有效分型和個(gè)體化治療，因此，研究肝細(xì)胞癌相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)深入探究肝細(xì)胞癌的發(fā)病原因，篩選和鑒定肝癌診斷和分型的標(biāo)志物，以及開發(fā)新的治療方案等有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　研究方案和技術(shù)方法：
　　1.應(yīng)用Rea

7、l-time PCR、Western Blot和瓊脂糖凝膠電泳等方法鑒定ATF4敲除小鼠的基因型，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所使用的轉(zhuǎn)基因小鼠中ATF4基因敲除效果。
　　2.在ATF4全身敲除（純合子、雜合子及野生型）C57BL/6小鼠上，通過腹腔注射5％的CCL4試劑建立肝纖維化模型，再應(yīng)用Real-time PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)染色(IHC)的方法檢測(cè)肝纖維化過程中相關(guān)分子的變化。
　　3.利用ATF4全身敲除

8、小鼠純合子、雜合子及野生型C57BL/6小鼠分別建立腹腔注射5％CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型，應(yīng)用Real-time PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)肝纖維化過程中ATF4分子及其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的變化。
　　4.利用ATF4全身敲除小鼠純合子、雜合子及野生型C57BL/6小鼠分別建立腹腔注射5％CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)肝纖維化過程中細(xì)胞增殖相關(guān)分子的變化。

9、>　　5.利用ATF4全身敲除小鼠純合子、雜合子及野生型C57BL/6小鼠分別建立腹腔注射5％CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型，應(yīng)用TUNEL試劑盒測(cè)定肝纖維化過程中ATF4分子對(duì)細(xì)胞凋亡的影響情況。
　　6.利用ATF4全身敲除小鼠純合子、雜合子及野生型C57BL/6小鼠分別建立腹腔注射5％CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型，利用血液生化分析儀器檢測(cè)各組小鼠血液中AST、ALT含量，評(píng)價(jià)ATF4敲除后肝細(xì)胞損傷程度的差異。
　　7.利用AT

10、F4全身敲除雜合子小鼠與野生型C57BL/6小鼠分別建立膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)肝纖維化模型，應(yīng)用Real-time PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)BDL誘導(dǎo)肝纖維化過程中ATF4分子及其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的變化。
　　8.利用ATF4全身敲除雜合子小鼠與野生型C57BL/6小鼠分別建立膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)肝纖維化模型，利用血液生化分析儀器檢測(cè)各組小鼠血液中AST、ALT含量，評(píng)價(jià)ATF4敲除后

11、肝細(xì)胞損傷程度的差異。
　　9.應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)肝癌患者的癌與癌旁組織樣本中ATF4及其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)量差異。
　　10.應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)小鼠DEN+CCL4誘導(dǎo)的樣本中ATF4及其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)量差異。
　　11.對(duì)含354例肝癌病人的組織芯片進(jìn)行ATF4的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)合病人隨訪信息分析ATF4與病人預(yù)后的相關(guān)性;利用單因素分析、多因素分析ATF

12、4對(duì)肝癌病人預(yù)后的指導(dǎo)價(jià)值。
　　研究結(jié)果：
　　1.ATF4全身敲除純合子及雜合子小鼠的ATF4表達(dá)在mRNA和蛋白水平均顯著低于野生型C57BL/6小鼠，說明了ATF4敲除可能抑制了肝纖維化的發(fā)生。
　　2.在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除純合子及雜合子小鼠的肝纖維化程度均低于野生型C57BL/6小鼠，且純合子小鼠纖維化程度最低。
　　3.在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除純合子及雜

13、合子小鼠的ATF4水平均低于野生型C57BL/6小鼠，且純合子小鼠含量最低。
　　4.在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除純合子及雜合子小鼠的肝細(xì)胞增殖程度水平均低于野生型C57BL/6小鼠，且純合子小鼠增殖水平最低。
　　5.在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除雜合子小鼠的肝細(xì)胞凋亡程度低于野生型C57BL/6小鼠。
　　6.在CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除純合子及雜合子小鼠的血液中

14、AST、ALT含量均低于野生型C57BL/6小鼠，肝細(xì)胞損傷程度低。
　　7.在BDL誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除雜合子小鼠的ATF4及其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)水平均低于對(duì)照組。
　　8.在BDL誘導(dǎo)肝纖維化模型中，ATF4全身敲除雜合子小鼠血液中AST、ALT含量均低于野生型C57BL/6小鼠，肝細(xì)胞損傷程度低。
　　9.人肝癌樣本中，癌組織中的ATF4分子表達(dá)量明顯高于癌旁，且呈現(xiàn)細(xì)胞核定位。
　　

15、10.小鼠肝癌樣本中，癌組織中的ATF4分子表達(dá)量明顯高于癌旁，且呈現(xiàn)細(xì)胞核定位。
　　11.進(jìn)一步結(jié)合患者臨床預(yù)后資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，ATF4高表達(dá)組患者復(fù)發(fā)時(shí)間顯著早于低表達(dá)組，且總體生存期明顯短于低表達(dá)組。
　　研究結(jié)論和討論：
　　本課題第一部分研究主要利用腹腔注射CCL4及BDL兩個(gè)肝纖維化模型證明了ATF4敲除小鼠的肝纖維化程度明顯低于野生型小鼠，BDL之后的死亡率也明顯低于對(duì)照組小鼠，說明ATF4敲除有

16、減弱肝纖維化的作用;證實(shí)了ATF4分子在肝癌標(biāo)本中表達(dá)水平高于癌旁。進(jìn)一步探究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)ATF4敲除組小鼠在增殖與凋亡兩個(gè)方面均弱于對(duì)照組。通過WB及RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn)了ATF4表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致CHOP表達(dá)量減少，細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)證實(shí)ATF4的缺失減弱CHOP介導(dǎo)的凋亡變化，提示ATF4缺失可能減輕由CHOP介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，減輕肝臟炎癥微環(huán)境，使肝纖維化程度減輕。第二部分研究通過分析化學(xué)性(DEN)誘癌小鼠模型標(biāo)本和肝癌患者組織標(biāo)