Ac-SDKP通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕纖維化模型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、目的：
　　通過體內(nèi)實驗和體外實驗，探討特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）病程中，Ac-SDKP通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激進而干預上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程而延緩肺纖維化發(fā)展的作用機制。
　　方法：
　　體內(nèi)實驗：將24只健康雄性C57BL/6小鼠（體重25±2g）隨機分為3組：假手術(shù)對照組(N組，n=8只)、肺纖維化模型組（M組，n=8只）、肺纖維化+Ac-SDKP干預治療組（P組,n=8只）。M組及P組小鼠采用氣管內(nèi)注入博來霉素（5 m

2、g/kg，共配制成50μl混合溶液）法制備小鼠肺纖維化模型，21天后于P組小鼠腹腔內(nèi)埋入Ac-SDKP藥物微量釋放泵（內(nèi)含Ac-SDKP混合溶液：Ac-SDKP800 ug.kg-1.d-1，冰乙酸0.1 M，卡托普利100 mg.kg-1.d-1,溶液配制劑量經(jīng)查詢大量國內(nèi)外文獻而定），持續(xù)干預21天。N組造模方法同M組，氣管內(nèi)注入等體積（50μl）0.9％氯化鈉生理鹽水。N組和M組小鼠于造模完成后第21天處死，而P組小鼠于Ac-SD

3、KP干預治療后第21天處死，取肺組織，染色并觀察其病理學變化；羥脯氨酸含量測定，判斷肺纖維化模型制備是否成功并評估肺組織纖維化嚴重程度；Western Blot、免疫組化法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP，間質(zhì)組織標志物Vimentin，上皮組織標志物E-cadherin蛋白水平表達的變化。
　　體外實驗：體外培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮細胞株（A549細胞），并于無血清同步化處理24小時后給予TGF-β干預24小時，模擬體外肺纖

4、維化病理改變及EMT相關(guān)細胞形態(tài)學變化，并于給予Ac-SDKP（80 mmol/L）干預24小時后收集細胞，細胞分組如下：正常對照組（N組）、TGF-β干預組（T組）、TGF-β+Ac-SDKP干預組（T+A組）、單獨Ac-SDKP干預組（A組）。使用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)學變化并拍照，qRT-PCR檢測各組細胞中GRP78、CHOP、Vimentin、E-cadherin等指標mRNA水平表達的變化。
　　結(jié)果:

5、　　體內(nèi)實驗：1、肉眼觀察：N組小鼠肺組織呈淡粉色，表面及切面光滑，未見結(jié)節(jié)形成及明顯出血點；M組小鼠雙肺色澤晦暗，表面及切面均可見散在小結(jié)節(jié)及大小不等出血點；P組小鼠肺組織表面亦可見上述異常表現(xiàn)，但較M組小鼠變化為輕。2、HE及Masson染色：M組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯纖維化改變。與M組相比，P組小鼠肺纖維化程度有所減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。3、羥脯氨酸含量測定（HYP）：M組小鼠肺組織HYP含量較N組明顯升高；P組較M組

6、降低，而較N組仍有所升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。4、免疫組化結(jié)果：（1）N組小鼠肺組織中，E-cadherin表達部位及表達量較多，M組較N組表達明顯減少，P組E-cadherin陽性表達量居于N組與M組之間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（2）N組小鼠肺組織中，Vimentin僅少量陽性表達且表達范圍較小，而M組中，Vimentin的表達量較N組明顯增加且廣泛表達于肺泡細胞胞漿及肺組織間質(zhì)基質(zhì)中，P組Vimentin陽

7、性表達量居于N組與M組之間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（3）CHOP及GRP78廣泛表達于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞，且M組表達量均高于N組，而P組表達量則介于N組與M組之間（P＜0.05）。5、Western Blot結(jié)果：與N組比較， M組CHOP、GRP78、Vimentin表達量均升高；E-cadherin的表達量降低；而P組各指標蛋白陽性表達量均介于N組與M組之間，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。<

8、br>　　體外實驗：1、A549細胞形態(tài)學變化：經(jīng) TGF-β干預后，細胞呈紡錘樣、成纖維細胞樣形態(tài)改變。2、qRT-PCR結(jié)果：與N組比較，M組CHOP、GRP78、Vimentin mRNA表達量均升高，E-cadherin mRNA的表達量降低，而P組各指標mRNA表達量均介于N組與M組之間，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中，Ac-SDKP可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)減