鈣離子誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：探討小鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)以及肺成纖維細(xì)胞凋亡情況，本研究使用鈣離子拮抗劑-粉防己堿（Tetrandrine,Tet）和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑-毒胡蘿卜素（Thapsigargin,TG）體外作用小鼠肺成纖維細(xì)胞，觀(guān)察鈣離子（Ca2+）失衡時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）指標(biāo)和細(xì)胞凋亡情況，從ERS途徑探討細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，闡明Ca2+、ERS、細(xì)胞凋亡的作用機(jī)

2、理，為臨床上防治肺纖維化疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：液氮凍存的小鼠肺成纖維細(xì)胞，放入37℃恒溫水浴箱內(nèi)進(jìn)行融化，快速接種于剛配置好的完全培養(yǎng)基內(nèi)，放置于5％CO2、37℃恒溫孵育箱內(nèi)，定期通過(guò)倒置相差顯微鏡觀(guān)察培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，經(jīng)常規(guī)的換液、傳代培養(yǎng)和同步化。根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果將細(xì)胞分為4組，即對(duì)照組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組。對(duì)照組細(xì)胞給予完全培養(yǎng)基，其他3組給予5ng/ml

3、 TGF-β1作用24h后，鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組再分別給予5mg/l Tet和4μM TG作用細(xì)胞24h。進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期比例、激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、Western-blot方法檢測(cè)Ⅰ型膠原、GRP78、Calpain-2、CHOP，免疫組織細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1細(xì)胞形態(tài)對(duì)照組和TGF

4、-β1組在掃描電子顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞膜、細(xì)胞核、染色質(zhì)形態(tài)完整，加入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑的兩組細(xì)胞均出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)：細(xì)胞漿濃縮、細(xì)胞體積縮小、染色質(zhì)逐漸聚集呈月牙形等。2細(xì)胞周期各組間，G1期、S期、G2期變化均有顯著性差異（P<0.05）；與對(duì)照組相比較，加入TGF-β1作用后的細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例降低（P<0.05），S期細(xì)胞比例明顯增加（P<0.05），G2期細(xì)胞比例下降（P<0.05）；與TGF-β1組相比較，加

5、入鈣離子拮抗劑、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑作用后的細(xì)胞，G2期和S期細(xì)胞比例均明顯減少（P<0.05），G1期比例均明顯增加（P<0.05）；3細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、TGF-β1組、鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組的凋亡率分別為6.73%、5.03%、9.60%、21.53%，各組間比較差異顯著（P<0.05）；鈣離子拮抗劑組和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組凋亡率明顯高于對(duì)照組和TGF-β1組。4 Ca2+濃度各組間比較差異顯著（P<0.

6、05）；與對(duì)照組相比較，TGF-β1組細(xì)胞內(nèi)熒光度值變化不明顯（P>0.05）；與TGF-β1組相比較，加入鈣離子拮抗劑后，細(xì)胞內(nèi)的熒光度值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但加入肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑后，細(xì)胞內(nèi)熒光度值明顯升高（P<0.05）；5 Western-blot檢測(cè)結(jié)果各組間成纖維細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白、GRP78、CHOP和Calpain-2蛋白的表達(dá)均有顯著性差異（P<0.05）；TGF-β1組的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯高

7、于對(duì)照組（P<0.05），但鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著降低對(duì)照組和TGF-β1組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，TGF-β1組的GRP78和CHOP蛋白表達(dá)差異不明顯（P>0.05），而鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組GRP78和CHOP蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組和TGF-β1組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，TGF-β1組和鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達(dá)差異不明顯（P>0.05），肌漿網(wǎng)

8、鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05），而鈣離子拮抗劑組的Calpain-2蛋白表達(dá)與TGF-β1組比較差異不明顯（P>0.05），肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組Calpain-2蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；6免疫細(xì)胞組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果各組間成纖維細(xì)胞內(nèi)caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)均有顯著性差異（P<0.05）；與對(duì)照組相比，TGF-β1組的caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)差異不明顯（

9、P>0.05），鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05），與TGF-β1組比較，鈣離子拮抗劑組、肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑組兩組caspase-12、caspase-3蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：1鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑能改變成纖維細(xì)胞周期分布，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡。2鈣離子拮抗劑和肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑可使肺成纖維細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，誘導(dǎo)ERS，