ATF3、ATF4、KLF2調(diào)控Nrf2-γ-GCSc在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、背景:慢性氣道炎癥是支氣管哮喘發(fā)病的本質(zhì),大量炎細(xì)胞刺激產(chǎn)生過多ROS,引起氧化應(yīng)激,進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)與氣道損傷。谷胱甘肽(glutathione,GSH)是肺內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì),存在于氣道分泌物和BALF中。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基(γ-glutamylcysteine synthetase catalytic subunit,γ-GCSc)是GSH生物合成的限速酶,具有非常重要的抗氧化作用。紅系衍生的核因子2相關(guān)因子2(

2、NF-E2-related factor2,Nrf2)是一種抗氧化轉(zhuǎn)錄因子,能上調(diào)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)介導(dǎo)的靶基因(如γ-GCSc等)抗氧化酶的表達(dá)。激活轉(zhuǎn)錄因子3( Activating transcription factor3,ATF3)、ATF4和Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like Factor2,KLF2),都是應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激時(shí),ATF3、ATF4能與Nrf2結(jié)合形成異二聚體;而KLF2能增

3、加Nrf2的核定位及其活性,三者都能作用于Nrf2調(diào)控其介導(dǎo)的抗氧化靶基因(如γ-GCSc)的表達(dá)。
　　目的:探討ATF3、ATF4、KLF2調(diào)控Nrf2/γ-GCSc表達(dá)及其在支氣管哮喘氧化應(yīng)激機(jī)制中的作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分兩部分。1.動物實(shí)驗(yàn)部分:30只健康雄性豚鼠隨機(jī)分為對照組(A組)、哮喘組(B組)和地塞米松治療組(C組),卵清蛋白致敏激發(fā)法復(fù)制支氣管哮喘急性發(fā)作期模型;HE染色觀察三組豚鼠肺組織(主要為細(xì)支氣管

4、)病理形態(tài)學(xué)變化并測支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù);檢測三組肺組織勻漿中及 BALF中ROS、丙二醛(MDA)濃度;RT-PCR法、原位雜交法和western blot法、免疫組織化學(xué)法分別檢測肺組織ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測BALF細(xì)胞中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc蛋白質(zhì)的表達(dá)。2.臨床實(shí)驗(yàn)部分:分健康對照組、(急性發(fā)作期)哮

5、喘患者(治療前)組、治療后三組,均行肺功能檢查;測三組痰液中ROS、MDA濃度;免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組痰涂片細(xì)胞中ATF3、ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.動物實(shí)驗(yàn)部分:(1)B組豚鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS％)顯著高于A組(P<0.01),B組肺組織細(xì)支氣管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,及明顯氣道重塑改變,而C組BALF炎細(xì)胞變化及肺組織病理改變較B組明顯減輕

6、;(2)豚鼠肺組織、BALF中ROS、MDA濃度,B組明顯高于A組,C組較B組降低(P均<0.05);(3)豚鼠肺組織中 ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCScmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),B組低于 A組和C組(P均<0.05);ATF3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),B組高于A組和C組(P均<0.05);(4)豚鼠BALF細(xì)胞中ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc蛋白質(zhì)的表達(dá),B組低于A組和C組(P均<0.05),而ATF3蛋白質(zhì)表達(dá),B組

7、高于A組和C組(P均<0.05)。
　　2.臨床實(shí)驗(yàn)部分:(5)哮喘患者痰液中ROS、MDA濃度高于健康對照組和治療后組(P均<0.01);(6)哮喘患者痰中細(xì)胞內(nèi)ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc蛋白表達(dá)治療后高于治療前(P均<0.01),而ATF3蛋白質(zhì)表達(dá)治療后低于治療前(P<0.01)。
　　3.直線相關(guān)性分析:(7)豚鼠肺組織ATF4、KLF2 mRNA及蛋白表達(dá)與Nrf2、γ-GCSc mRNA及蛋白表達(dá)

8、呈正相關(guān)(P均<0.01);ATF3mRNA及蛋白表達(dá)與Nrf2、γ-GCSc mRNA及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01)。(8)豚鼠BALF細(xì)胞和哮喘患者痰細(xì)胞內(nèi) ATF4、KLF2蛋白表達(dá)與 Nrf2、γ-GCSc蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P均<0.01);ATF3蛋白表達(dá)與 Nrf2、γ-GCSc蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01)。(9)豚鼠肺組織、BALF細(xì)胞和哮喘患者痰液細(xì)胞內(nèi)ATF4、KLF2、Nrf2、γ-GCSc表達(dá)水平與RO

9、S、MDA濃度及BALF中炎細(xì)胞總數(shù)、EOS%均呈負(fù)相關(guān),ATF3表達(dá)與ROS、MDA濃度及BALF中炎細(xì)胞總數(shù)、EOS%均呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:1.支氣管哮喘急性發(fā)作期豚鼠模型肺組織及患者痰液細(xì)胞中存在氧化應(yīng)激,刺激Nrf2/γ-GCSc表達(dá)抵抗氧化損傷,對組織/細(xì)胞起保護(hù)作用。2.抗炎治療后ROS、MDA等氧化物減少,ATF4、KLF2表達(dá)增加而ATF3表達(dá)降低,可能通過增加Nrf2/γ-GCSc表達(dá),提高抗氧化能力,在支氣管