酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶在支氣管哮喘發(fā)病機制中的作用.pdf

1、支氣管哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞和細胞組分)參與的氣道慢性炎癥性疾病。其中，Th1和Th2淋巴細胞亞群數(shù)目和(或)功能失衡，以及Th1/Th2比例失調(diào)，在哮喘發(fā)病中起重要作用；而Treg細胞能以“主動“方式來維持機體的免疫平衡；糾正這種失衡的免疫學反應是控制哮喘發(fā)作的一個重要研究方向。 幾丁質(zhì)微粒(CMP)是指直徑1～20μm幾丁質(zhì)顆粒，研究顯示它可降低哮喘小鼠氣道炎癥，增加

2、IFN-γ的表達。目前研究發(fā)現(xiàn)，酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶(AMCase)的表達與支氣管哮喘密切相關(guān)，能有效影響TH2炎癥因子表達，但其不影響IL-4、IL-5、IL-13、IFN-Y以及STAT-6的表達。由于動物研究顯示幾丁質(zhì)酶常在致敏原刺激7天后明顯表達，提示幾丁質(zhì)酶與氣道重塑可能有關(guān)，AMCase在支氣管哮喘病理生理機制中起到不可忽略的作用。 已知，哺乳動物體內(nèi)不存在幾丁質(zhì)合成酶，但酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶的發(fā)現(xiàn)，有理由引起研究者

3、對幾丁質(zhì)和酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶對哺乳動物作用相互關(guān)系的興趣；兩者對支氣管哮喘病理生理機制如何影響?以及如何相互影響?有待進一步研究。 第一部分幾丁質(zhì)微粒對支氣管哮喘小鼠TH2型趨化因子、TGF-β1、AMCase表達的影響 目的:觀察幾丁質(zhì)微粒對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、TH2型趨化因子及TGF-β1、AMCase表達的影響。 方法: BALB/C小鼠分為四組，分別為哮喘組、對照組、經(jīng)口幾丁質(zhì)組、經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組。哮喘

4、組、兩幾丁質(zhì)干預組(CMP 40gg)經(jīng)卵清蛋白致敏14天后，最后一次OVA霧化結(jié)束后24h，收集BALF進行細胞計數(shù)和分類，測定BALF中IL-10和TGF-β1；流式細胞檢測Th1、Th2、Treg比例；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測肺組織TGF-β1的表達；原位雜交方法檢測肺組織AMCase mRNA；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)半定量測定肺組織內(nèi)TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、

5、STAT1和C-jun mRNA表達。 結(jié)果:各幾丁質(zhì)組較哮喘組小鼠氣道炎癥明顯減輕，BALF嗜酸性粒細胞數(shù)量明顯減少。幾丁質(zhì)組Th1淋巴細胞比例較哮喘組明顯增高，TGF-β1的表達、小鼠肺組織AMCase、STAT1mRNA的表達明顯降低。經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組TARC mRNA的表達較哮喘組和對照組明顯增高，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)經(jīng)口幾丁質(zhì)組MDCmRNA表達較哮喘組明顯增高，但經(jīng)鼻幾丁質(zhì)組MDC mRNA的表達較哮喘組明顯

6、減低。經(jīng)口幾丁質(zhì)組NF-κB、C-jun mRNA的表達較哮喘組明顯增高。 結(jié)論:幾丁質(zhì)微?？赏ㄟ^提高Th1細胞比例在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，降低肺組織TGF-β1、STAT1和AMCase mRNA的表達。幾丁質(zhì)微?？纱龠M肺組織TARC、NF-κB、C-jun mRNA的表達。 第二部分幾丁質(zhì)酶抑制劑對支氣管哮喘小鼠TH2型趨化因子、TGF-β1表達的影響 目的:觀察幾丁質(zhì)酶抑制劑對支氣管哮喘小鼠氣道

7、炎癥、TH2型趨化因子及TGF-β1表達的影響。 方法:BALB/C小鼠分為三組，分別為哮喘組、對照組和抑制劑組。哮喘組、抑制劑組(0.5mg/kg)經(jīng)卵清蛋白致敏14天后，最后一次OVA霧化結(jié)束后24h，收集BALF進行細胞計數(shù)和分類，測定BALF中IL-10和TGF-β1；流式細胞檢測Th1、Th2、Treg比例；H-E染色觀察肺組織炎癥改變；用免疫組化方法檢測肺組織TGF-β1的表達；原位雜交方法檢測肺組織AMCase m

8、RNA；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)半定量測定肺組織內(nèi)TGF-β1、AMCase、TARC、MDC、NF-κB、STAT1和C-jun mRNA表達。 結(jié)果:幾丁質(zhì)酶抑制劑組較哮喘組小鼠氣道炎癥明顯減輕，BALF中嗜酸性粒細胞明顯減少，TGF-β1、STAT1 mRNA的表達顯著降低；BALF中IL-10水平和脾單核細胞中Treg細胞比例明顯提高，C-jun mRNA的表達增加。 結(jié)論:幾丁質(zhì)酶抑制劑可促進Tre

9、g細胞表達，降低肺組織TGF-β1和STAT1 mRNA的表達，提高肺組織C-jun mRNA的表達，在一定程度上減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。 第三部分酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶mRNA表達及其影響因素探討 目的:觀察人支氣管上皮細胞(HBE)酸性哺乳動物幾丁質(zhì)酶(AMCase)表達特點，及幾丁質(zhì)微粒(CMP)和布地奈德的影響。 方法:HBE細胞分別與細胞因子共同孵育2、4、8、16、24，48和72小時。HBE細胞分別與

10、細胞因子和干預劑CMP、布地奈德共同孵育24小時。用Realtime PCR方法測定HBE細胞AMCase mRNA表達； 結(jié)果:IL-13刺激HBE 24小時AMCase mRNA表達未見明顯變化。IL-4刺激HBEAMCase mRNA表達呈波浪樣變化，在48h表達為一高峰，在2h存在一小峰值，但于刺激后72小時，AMCase mRNA的表達卻明顯降低，幾乎接近刺激前的基因表達水平。TNF-α、Der P1、IL-13+De

11、r P1和IL-4+Der P1刺激對HBE AMCase mRNA表達，隨著時間延長，其表達逐漸升高；Der P1在刺激4h，IL-4+Der P1在刺激2h表達有一峰值。CMP可促進IL-13+Der P1和IL-4+Der P1誘導HBE表達AMCasemRNA，該作用可被布地奈德逆轉(zhuǎn)，又可降低HBE AMCase mRNA表達。 結(jié)論:IL-4、TNF-α、Der P1和CMP可直接作用于支氣管上皮細胞促進AMCase

12、mRNA。糖皮質(zhì)激素可降低AMCase mRNA表達。 第四部分AMCase對人支氣管上皮細胞TARC、TGF-β1、ICAM-1mRNA表達的影響 目的:觀察人支氣管上皮細胞(HBE)AMCase對TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表達的影響。 方法:應用RNA干擾技術(shù)，HBE和RNAiHBE細胞分別與細胞因子共同孵育24小時，觀察AMCase干擾前后TARC、TGF-β1、ICAM-1 mRNA表