ATF3調(diào)控神經(jīng)元凋亡的機制.pdf

1、本論文主要是對其中一個較特殊的候選靶基因一ATF3進行深入研究。 轉錄激活因子3(Activating TYanscription Factor 3，ATF3)是bZIP家族ATF/CREB亞家族的成員之一，能被多種誘導因子誘導的應激極早表達基因。ATF3含有典型的bZIP序列，依靠亮氨酸拉鏈結構形成二聚體發(fā)揮作用，當ATF3形成同二聚體時會抑制基因的表達，其具體的作用位點是第40-84位氨基酸序列，此序列是發(fā)揮抑制作用的活性部

2、位，因此含有與該位點結合的啟動子能被ATF3抑制；而當ATF3與ATF/CREB家族其他成員ATF2、c-Jun、JunB、或JunD等形成異二聚體時，依啟動子和細胞狀態(tài)發(fā)揮轉錄激活或抑制作用。所以，ATF3形成二聚體的形式?jīng)Q定了ATF3在細胞內(nèi)發(fā)揮促凋亡還是抗凋亡作用，同時ATF3還能通過選擇性剪接體ATF3Azip對靶基因的轉錄發(fā)揮間接調(diào)控作用。 ATF3對細胞凋亡進程的調(diào)控起著很重要的作用。在非神經(jīng)元細胞凋亡時，ATF3在

3、促凋亡和抗凋亡兩方面的作用都有報道。在神經(jīng)元損傷時ATF3被誘導上調(diào)，并且被認為是神經(jīng)元損傷的標記指標；也有通過過表達ATF3的方法報道了ATF3對神經(jīng)元具有保護作用。但是，作為一種由二聚體組成成分決定其調(diào)節(jié)功能的轉錄因子，過表達ATF3是不能揭示內(nèi)源性的ATF3對神經(jīng)元凋亡所起的作用。所以本研究利用RNA干擾技術，揭示內(nèi)源性ATF3在撤鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用。同時，為了更進一步闡明過表達ATF3對神經(jīng)元的保護作用，本文在過

4、表達ATF3的基礎上，探討其發(fā)揮保護性干預神經(jīng)元凋亡功能的可能機制。 第一部分c-Jun靶基因ATFl3促進小腦顆粒神經(jīng)元凋亡 1，撤鉀誘導小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，JNK/c-Jun通路激活及ATF3表達上調(diào)將小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)6天后，分別用25 mM KCI(25K)或5mM KCI(5 K)培養(yǎng)基處理0.5、1、2、4小時。收集蛋白后用磷酸化特異的JNK抗體檢測JNK是否被激活。將體外培養(yǎng)了6天的小腦顆粒神經(jīng)元分別

5、共轉染EGFP和空載體、shatf3a或shatt3b。在轉染48小時后，換25K或5K.模型處理12小時，Hoechst33258染色。倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，細胞核固縮或碎裂記為凋亡細胞，以GFP陽性細胞數(shù)為總數(shù)，計算凋亡率。實驗結果表明，轉染了干擾質(zhì)粒shatf3a或shatf3b的神經(jīng)元5 K凋亡率明顯降低。這些結果表明：干擾ATF3保護性地干預撤鉀誘導的小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡。 第二部分過表達ATF3保護性干預小腦顆粒