ATF3促進(jìn)成年斑馬魚(yú)脊髓再生.pdf

1、背景：脊髓損傷是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)致殘性疾病,目前針對(duì)脊髓損傷尚無(wú)有效的治療手段和藥物。哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)擁有非常有限的修復(fù)和再生能力。與哺乳動(dòng)物不同，斑馬魚(yú)在脊髓損傷后具有很強(qiáng)的修復(fù)和再生能力，成年斑馬魚(yú)在脊髓損傷后六周時(shí)間內(nèi)可基本恢復(fù)正常運(yùn)動(dòng)水平，但其具體機(jī)制尚不明確。已有研究證明活化轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3）在斑馬魚(yú)視神經(jīng)損傷后可以促進(jìn)視神經(jīng)細(xì)胞再生和修復(fù)。這提示我們，在斑馬魚(yú)脊髓損傷后，ATF3分子可能對(duì)神經(jīng)再生和修復(fù)起到重要作

2、用。
　　目的：本課題利用成年斑馬魚(yú)脊髓橫斷模型，探究ATF3在脊髓損傷后的mRNA和蛋白水平的變化。同時(shí)在抑制ATF3蛋白表達(dá)后，研究其對(duì)斑馬魚(yú)脊髓修復(fù)的影響和相關(guān)機(jī)制。
　　方法：選用4-6月齡的成年斑馬魚(yú)進(jìn)行脊髓橫斷模型手術(shù)，在損傷后不同時(shí)間點(diǎn)取損傷點(diǎn)下段4mm的脊髓組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，原位雜交以及免疫熒光，檢測(cè)ATF3 mRNA和蛋白變化，同時(shí)在脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)用免疫熒光共標(biāo)ATF3與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或ATF3與放

3、射狀膠質(zhì)細(xì)胞。斑馬魚(yú)脊髓損傷后，用ATF3 morpholino（MO）抑制斑馬魚(yú)脊髓損傷后ATF3蛋白質(zhì)表達(dá)，檢測(cè)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況以及穿過(guò)損傷位點(diǎn)神經(jīng)軸突修復(fù)的水平變化，同時(shí)用實(shí)時(shí)定量 PCR的方法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA的表達(dá)水平變化以探究炎癥因子對(duì)修復(fù)的影響。最后，利用顯微注射技術(shù)將ATF3 MO注射到斑馬魚(yú)胚胎中，探究ATF3分子對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育的影響。
　　結(jié)果：
　

4、　1.ATF3 mRNA水平在斑馬魚(yú)脊髓損傷后的4小時(shí)、12小時(shí)和6天維持在較高的表達(dá)水平，而在損傷后11天，其恢復(fù)到假手術(shù)組的表達(dá)水平。
　　2.ATF3蛋白水平在脊髓損傷后的4小時(shí)、12小時(shí)和6天表達(dá)水平升高，11天降低到假手術(shù)組水平。
　　3.ATF3蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞漿中，并且在脊髓損傷后12小時(shí)和6天表達(dá)水平增高。
　　4.ATF3蛋白毗鄰但不表達(dá)在放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中，在脊髓損傷后6天，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)

5、量增加。
　　5.ATF3 MO抑制ATF3蛋白在斑馬魚(yú)脊髓內(nèi)表達(dá)后，脊髓損傷后第5和第6周，抑制組斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力分別降低了36.4％和35.7%。
　　6.通過(guò)神經(jīng)示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，抑制脊髓ATF3表達(dá)六周后，神經(jīng)軸突修復(fù)被抑制。
　　7.抑制脊髓ATF3表達(dá)11天后，相比MO對(duì)照組，抑制組TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平維持在高水平，在脊髓損傷后21天，恢復(fù)到對(duì)照組水平。
　　8.ATF3 MO抑制ATF3