斑馬魚缺氧誘導因子-3α核定位信號的研究.pdf

1、缺氧誘導因子(HIFs)是最主要的能夠應答細胞內(nèi)氧氣濃度的降低而對多種基因進行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族,與生物體的生長、發(fā)育及一些疾病的發(fā)病機理都有著密切的聯(lián)系。由于生物體內(nèi)缺氧現(xiàn)象較為普遍,所以有關HIF的結構、功能以及與多種疾病之間的關系等一直是熱門的研究領域。HIF是一種異源二聚體蛋白,由α亞基和β亞基組成,其中α亞基受細胞內(nèi)氧氣濃度精密調(diào)控,對HIF功能的發(fā)揮是十分關鍵的。哺乳動物中HIF-α一共有三個成員,分別稱為HIF-1α,HI

2、F-2α和HIF-3α,三者在蛋白結構上較為保守。在缺氧狀態(tài)下,HIF-α得到穩(wěn)定積累并進入細胞核與HIF-1β結合形成有功能的轉(zhuǎn)錄復合體調(diào)控相關基因的表達。
　　 根據(jù)對HIF-1α和HIF-2α的研究可知,HIF-α無論在蛋白穩(wěn)定性還是其對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能方面都受到細胞內(nèi)多條途徑的調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子,HIF-α蛋白是否能從細胞質(zhì)成功被轉(zhuǎn)運進入細胞核是其發(fā)揮功能的前提,所以針對HIF-α在細胞中亞定位的研究十分必要。已知分

3、子量大于50kDa的蛋白質(zhì)不同于小分子,它們需要通過消耗能量的主動運輸過程才能穿越核孔復合體進入到細胞核中,在這些蛋白結構上往往存在特殊的核定位信號(NLS)使得能夠蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)運入核內(nèi)。文獻報道,在細胞中檢測外源性或內(nèi)源性的HIF-1α和HIF-2α蛋白發(fā)現(xiàn)兩者均能夠定位于細胞核中,并且缺氧能夠誘導兩種蛋白的表達全部集中于核內(nèi)。在HIF-1α和HIF-2α的蛋白結構中,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證明了核定位信號存在的具體位點。在它們的C-端區(qū)

4、域都包含有一段富含堿性氨基酸(Lys和Arg)的片段,當這些氨基酸被刪除或被替換成其它氨基酸時蛋白便完全失去進入細胞核的能力。然而,由于HIF-3α較前兩者較晚被克隆得到,所以目前對該蛋白是否也為核內(nèi)蛋白,其進核能力是否會受到氧氣濃度的影響以及該蛋白結構上是否也存在核定位信號等等一系列的問題尚未得到解答。本研究的目的就是要對上述疑問一一進行探討。以斑馬魚Hif-3α作為對象觀察該蛋白在細胞中的核質(zhì)分布以及確定其核定位信號存在的位點。從斑

5、馬魚體內(nèi)克隆得到了hif-3α的全長cDNA,其開放閱讀框共編碼626個氨基酸。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)該蛋白和人類的HIF-3α相似性在40％左右,說明兩者的保守性比較高。利用Hif-3α進行核定位信號的研究能夠幫助我們完善對三種HIF-α亞基在結構上相同點和不同點的認識。
　　 將Hif-3α蛋白全長以及缺失N-端或C-端氨基酸片段的突變蛋白與EGFP構建成融合蛋白后用相應的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞后發(fā)現(xiàn),在常氧時Hif-3α

6、-EGFP蛋白便已能夠集中于細胞核分布,缺氧并不能對它的細胞亞定位產(chǎn)生影響。而N-端或C-端區(qū)域缺失突變體轉(zhuǎn)染結果提示Hif-3α的C-端區(qū)域具有進核的功能。利用特異性表達于細胞質(zhì)的β-Gal—EGFP蛋白進一步實驗證明Hif-3α的C-端第518-567位和第568-626位兩個氨基酸片段各自具備進核的功能。在每個片段中都存在堿性氨基酸對其功能的發(fā)揮有不可或缺的作用,它們分別為K524,R525,K578以及R579。在Hif-3α完

7、整蛋白的背景下將這些氨基酸突變后也使得蛋白的進核能力明顯減弱。在這兩個堿性氨基酸簇之間有一段長為52個氨基酸的連接區(qū)域,這些氨基酸共同組成一段有核定位功能的結構域,將其命名為Hif-3α的核定位信號。值得注意的是,發(fā)現(xiàn)Hif-3α N-端的第1—69位氨基酸片段也能夠介導β-Gal-EGFP進入細胞核中,其中發(fā)揮作用的氨基酸為R14,K15,R25和R26。但是在全長蛋白中該片段卻并沒有真正的核定位功能,這與之前在HIF-1α和HIF-