神經(jīng)元凋亡時(shí)JNK-c-Jun通路對(duì)puma的調(diào)控.pdf

1、凋亡而引起的神經(jīng)元丟失是神經(jīng)退行性疾病如帕金森病和老年性癡呆癥的主要病理特征。闡明對(duì)神經(jīng)元凋亡起關(guān)鍵性作用的蛋白質(zhì)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對(duì)揭示神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的本質(zhì)并尋找、確立藥物靶點(diǎn)，從而進(jìn)一步達(dá)到有效防治神經(jīng)退行性疾病的目的，具有至關(guān)重要的意義。 JNK/c-Jun通路在多種神經(jīng)元凋亡模型中激活，如撤NGF處理的交感神經(jīng)元，撤鉀處理的小腦顆粒神經(jīng)元，β淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元及MPTP引起的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元。阻斷JNK/c

2、-Jun通路活性可以保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡，顯示JNK/c-Jun通路為神經(jīng)元凋亡所必需。直接阻斷轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活性可以很好的保護(hù)神經(jīng)元，提示c-Jun觸發(fā)一些靶基因的表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)凋亡。然而，目前c-Jun促凋亡靶基因是什么并不清楚。本實(shí)驗(yàn)室用基因芯片技術(shù)篩選到一系列c-Jun候選靶基因(此部分工作在今年畢業(yè)的應(yīng)春怡博士生的畢業(yè)論文中做了詳細(xì)敘述)，并且已經(jīng)對(duì)其中一個(gè)候選靶基因Dp5進(jìn)行了深入研究(研究成果發(fā)表在J Biol Chem

3、．上)。在對(duì)JNK/c-Jun通路研究的工作基礎(chǔ)上，論文就另一可能被此通路調(diào)控的基因puma/Bbc3(1253 upregulated modulator of apoptosis/Bcl2 binding components 3)做一些探討。 神經(jīng)元凋亡的發(fā)生是通過線粒體凋亡通路所介導(dǎo)。各種凋亡刺激作用引起線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素e、AIF等促凋亡物釋放，進(jìn)而激活凋亡殺手 Caspase引起凋亡發(fā)生。Bcl2家族成員

4、在維持線粒體外膜的完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放這一過程中起到關(guān)鍵作用。Bcl2家族成員大致可以分成三大類，抗凋亡Bcl2家族成員如Bcl2，BclXL,MCL1，它們含有BHl-4結(jié)構(gòu)域；含有BHl-4結(jié)構(gòu)域的促凋亡家族成員如BAX，BAK激活后構(gòu)型發(fā)生變化形成寡聚體在線粒體外膜上形成孔道使其通透性增加；第三類是只含BH3結(jié)構(gòu)域的BH3-only蛋白家族成員，包括dp5，puma，bim，noxa，bmf等。BH3-only蛋白通過蛋白

5、質(zhì)相互作用阻斷抗Bcl2抗凋亡蛋白成員從而解除對(duì)BAX的抑制作用，或直接與BAX作用激活其功能。因此BH3-only蛋白被稱為凋亡的啟動(dòng)者，在凋亡的發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。 puma是在2001年發(fā)現(xiàn)的BH3-only蛋白家族成員，已經(jīng)證實(shí)其在多種細(xì)胞系的凋亡過程中起到重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)puma在血清等促存活因子存在的情況下即可誘發(fā)神經(jīng)元凋亡；敲除或干擾puma可有效阻止多種凋亡刺激引起的神經(jīng)元凋亡，表明puma在神經(jīng)元凋亡中發(fā)

6、揮重要的作用。 puma基因是作為p53的促凋亡靶基因被發(fā)現(xiàn)的。長期以來p53作為促發(fā)細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，其靶基因一直不清楚。在2001年有文章指出，p53正是通過puma介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。其后，大量文章報(bào)道puma為p53促凋亡靶基因。直到2005年有研究表明過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子e2fl能使puma表達(dá)上調(diào)，這就提示了puma可能還受其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。事實(shí)上，在多個(gè)p53非依賴的細(xì)胞凋亡模型中，puma仍發(fā)揮重要作用，這就說明多

7、種信號(hào)通路參與puma基因的表達(dá)調(diào)控。在小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons，CGNs)撤鉀凋亡這一經(jīng)典的中樞神經(jīng)元凋亡模型中已發(fā)現(xiàn)puma蛋白表達(dá)上調(diào)，而敲除p53后并不影響凋亡的進(jìn)程，說明在此模型中puma的表達(dá)可能是p53非依賴的。而在交感神經(jīng)元撤NGF凋亡這一經(jīng)典的外周神經(jīng)元凋亡模型中，c-JWl突變體的神經(jīng)元中puma蛋白表達(dá)不如正常的高，提示puma可能為轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的靶基因。在此背景下

8、，本課題對(duì)撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)‘puma的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行研究。 本課題主要回答以下問題： 1．撤鉀誘導(dǎo)CGNs凋亡時(shí)puma mRNA是否表達(dá)上調(diào)? 2．p53在此凋亡過程中轉(zhuǎn)錄激活上調(diào)了嗎? 3．JNK/c-Jun通路在此凋亡過程中被激活了嗎? 4．假如上述通路被激活了，這種激活介導(dǎo)了puma的轉(zhuǎn)錄嗎? 5．puma能否促發(fā)神經(jīng)元凋亡? 結(jié)果： 1、撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆

9、粒神經(jīng)元凋亡模型中puma mRNA表達(dá)增加體外培養(yǎng)第7天小腦顆粒神經(jīng)元(DIV7 CGNs)，分別用25 mM KCl(25 K)或5 mM KCl(5 K)培養(yǎng)基處理1、2、4、6小時(shí)。收mRNA后做Q-PCR發(fā)現(xiàn)1小時(shí)后puma mRNA開始升高，并在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)持續(xù)增加。 2、p53的轉(zhuǎn)錄活性沒有被激活收集0、2、4、8、12小時(shí)的蛋白，做Western blot檢測(cè)p53的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)所有時(shí)間點(diǎn)p53蛋白量并沒有改變。用

10、對(duì)p53轉(zhuǎn)錄活性具有特異反應(yīng)性的報(bào)道基因檢測(cè)凋亡模型，發(fā)現(xiàn)該報(bào)道基因在凋亡時(shí)沒有反應(yīng)性。所以在此凋亡過程中，p53的轉(zhuǎn)錄活性并沒有激活。 3、JNK/c-Jun通路被激活收集時(shí)間點(diǎn)1、2、4小時(shí)的蛋白后用磷酸化特異的JNK抗體檢測(cè)JNK是否激活。發(fā)現(xiàn)，撤鉀處理1小時(shí)后JNK磷酸化水平就顯著增加，并在后續(xù)檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)持續(xù)增加，顯示JNK通路激活。同一張膜Stripping后檢測(cè)JNK總蛋白，顯示JNK蛋白質(zhì)總量保持一致，JNK磷酸

11、化信號(hào)的增加不是因?yàn)榈鞍咨蠘恿康牟町惗斐?。為了進(jìn)一步檢測(cè)JNK活性，我們用c-Jun磷酸化抗體(Ser73)檢測(cè)了JNK底物c-Jun磷酸化水平的變化。發(fā)現(xiàn)c-Jun磷酸化水平在撤鉀1小時(shí)后顯著增加，與JNK磷酸化變化趨勢(shì)基本一致。說明JNK/c-Jun通路被激活。 4、JNK活性介導(dǎo)了puma表達(dá)上調(diào)接下來我們阻斷JNK活性觀察puma表達(dá)變化。DIV7 CGNs分別用25 K，5K或5K加入MLK抑制劑CEPl1004處理

12、4小時(shí)后提取RNA，用Q-PCR方法檢測(cè)puma mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEPl1004可完全阻斷撤鉀引起的c-JunmRNA水平增加，顯示CEPl1004阻斷JNK活性。puma mRNA的上調(diào)可被CEPl 1004顯著但不完全抑制(～60﹪)。不完全抑制不是由于抑制量不足造成，因?yàn)榇藭r(shí)JNK活性已完全被阻斷(c-Jun mRNA增加被完全抑制)。為進(jìn)一步明確JNK在puma mRNA表達(dá)調(diào)控中的作用，我們用SP600125直接抑制

13、JNK活性。SP600125也明顯抑制撤鉀引起的puma mRNA增加(～66﹪)，與CEPl1004的結(jié)果相一致。我們的結(jié)果表明JNK介導(dǎo)puma mRNA表達(dá)上調(diào)，但同時(shí)也存在其他通路參與Dp5表達(dá)調(diào)控。 5、直接阻斷e-Jun活性抑制puma誘導(dǎo)表達(dá)為了研究c-Jun是否參與puma表達(dá)調(diào)控，我們直接阻斷c-Jun轉(zhuǎn)錄活性觀察puma表達(dá)變化。c-Jun負(fù)顯性突變體△169(截去c-Jun N末端168個(gè)氨基酸，去除了轉(zhuǎn)錄

14、激活區(qū)而保留DNA結(jié)合區(qū))可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合c-Jun的DNA結(jié)合位點(diǎn)從而發(fā)揮抑制c-Jun轉(zhuǎn)錄活性的功能。用Ad-A169把△169導(dǎo)入神經(jīng)元。DIV5 CGNs感染Ad-GFP或．Ad-A169(MOI=100)36小時(shí)后，25 K、5 K處量4小時(shí)。用Q-PCR的方法檢測(cè)puma表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)感染Ad-GFP的神經(jīng)元5 K處理后puma mRNA水平顯著上調(diào)，表明腺病毒本身本不會(huì)干預(yù)puma．基因的表達(dá)上調(diào)。而感染Ad-△169后，p

15、uma mRNA表達(dá)上調(diào)可被明顯抑制(～57﹪)。我們的結(jié)果表明c-Jun介導(dǎo)puma的表達(dá)上調(diào)。 6、過表達(dá)puma促發(fā)神經(jīng)元凋亡我們過表達(dá)了puma，發(fā)現(xiàn)其在存活因子存在的情況下即可引起神經(jīng)元凋亡，顯示其具有很強(qiáng)的促神經(jīng)元凋亡功能。 結(jié)論： 撤鉀誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)： 1．Q-PCR顯示puma基因的升高具有時(shí)效關(guān)系，puma被誘導(dǎo)上調(diào)； 2．Western blot、報(bào)道基因結(jié)