血管緊張素Ⅱ通過JNK-c-Jun途徑調(diào)節(jié)DDAH-ADMA-NO系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的:本課題利用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilicalvein endothelial cells，HUVECS)，觀察ANGⅡ處理下，細(xì)胞內(nèi)JNK/c-Jun通路的激活情況，并通過抑制JNK/c-Jun通路，觀察下游SREBP-1、DDAH-1蛋白質(zhì)水平的變化及ADMA和NO水平的變化，從而探討JNK通路在ANGⅡ影響DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)中的作用，為闡明ANGⅡ引起NO水平變化提供新的視角。
　　

2、方法:體外培養(yǎng)細(xì)胞株HUVECs，同步化處理后，加入不同濃度的ANGⅡ，孵育24小時，用Western blot檢測p-JNK，p-c-Jun表達(dá)水平的改變，從而觀察有無JNK/c-Jun信號通路的激活。以最大程度激活JNK/c-Jun通路的ANGⅡ處理濃度為最佳處理濃度。加入上述最佳處理濃度的ANGⅡ處理HUVECS不同時間，用Western blot檢測p-JNK，p-c-Jun表達(dá)水平的改變，找出可以最大程度激活JNK通路的ANG

3、Ⅱ最佳處理時間。用以上最佳處理濃度與處理時間的ANGⅡ處理HUVECs，用Western Blot檢測p-c-Jun，SREBP-1，DDAH-1水平。用高效液相色譜法測定細(xì)胞上清液中ADMA水平，DDAH總活性。硝酸還原酶法測定細(xì)胞上清液中NO水平。用JNK阻斷劑SP600125處理內(nèi)皮細(xì)胞后，用Western Blot檢測p-c-Jun，SREBP-1，DDAH-1水平。用高效液相色譜法測定細(xì)胞上清液中ADMA水平，DDAH總活性。

4、硝酸還原酶法測定細(xì)胞上清液中NO水平。
　　 結(jié)果:與對照組相比，不同濃度與時間ANGⅡ處理下，JNK與c-Jun的磷酸化水平表達(dá)均增高。在ANGⅡ處理濃度為10-6M，處理時間為24小時時，JNK與c-Jun的磷酸化表達(dá)達(dá)到高峰。表明在HUVECS中，ANGⅡ可引起JNK/c-Jun通路的激活。在對ANGⅡ影響下，JNK通路對SREBP-1，DDAH-1 DDAH總活性，ADMA含量，NO含量調(diào)節(jié)的研究中發(fā)現(xiàn):(1)與無抑制劑

5、處理組相比，加入JNK抑制劑SP600125處理后，SREBP-1表達(dá)無明顯差異，表明JNK通路在HUVECS中不參與對SREBP-1的調(diào)節(jié)。(2)與無抑制劑處理組相比，;加入JNK抑制劑SP600125處理后，DDAH-1的表達(dá)明顯增高，表明JNK通路參與調(diào)節(jié)ANGⅡ引起的DDAH-1表達(dá)降低。(3)與無抑制劑處理組相比，加入JNK抑制劑SP600125處理后，DDAH活性明顯增高，ADMA含量降低，NO含量增高，表明阻斷JNK通路參