JNK的激活通過c-Jun蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)Mule的表達(dá).pdf

1、背景：JNK信號(hào)通路對從細(xì)胞的增殖和分化到細(xì)胞的程序性死亡在內(nèi)的廣泛的細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié),都起到了非常關(guān)鍵的作用,同樣的,在一些疾病的發(fā)生和發(fā)展中也扮演了非常重要的角色,這其中包括糖尿病和癌癥。JNK在物理應(yīng)力,細(xì)胞因子,T細(xì)胞共刺激和生長因子等各種胞外刺激的作用下做出應(yīng)答,通過MAP激酶模式下一系列蛋白的順序性磷酸化得到激活。JNK有兩個(gè)普遍表達(dá)的同源異構(gòu)體,JNK1和JNK2。有報(bào)道說明JNK1,而非JNK2,是實(shí)現(xiàn)TNFα誘導(dǎo)的JNK激

2、活,c-Jun蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡所必需的。作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,Miz1通過激活或抑制轉(zhuǎn)錄參與調(diào)節(jié)了DNA損傷應(yīng)答,細(xì)胞周期停滯,細(xì)胞增值,分化和凋亡的過程。除了轉(zhuǎn)錄因子的功能,Miz1還可以作為信號(hào)或通路特異性的調(diào)節(jié)子(SMOR)特異性地調(diào)節(jié)TNFα誘導(dǎo)地JNK1激活和細(xì)胞死亡。在TNFα的刺激下,含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶Mule泛素化Miz1,釋放Miz1對JNK1激活的阻遏作用,進(jìn)而引起JNK信號(hào)通路的激活和細(xì)胞凋亡。

3、
　　 目的：盡管Mule控制一些關(guān)鍵分子的水平,調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能已經(jīng)得到了共識(shí),但是Mule仍是一個(gè)沒有得到透徹理解的新的蛋白。它巨大的結(jié)構(gòu)暗示Mule本身仍隱藏了許多的可能性。在高度動(dòng)態(tài)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中,Mule又是怎樣受到調(diào)節(jié)的機(jī)制仍不清楚。這篇論文嘗試證明,不僅Mule可以調(diào)節(jié)TNFα誘導(dǎo)的JNK激活和細(xì)胞凋亡,JNK的激活對Mule也有反饋效應(yīng),調(diào)節(jié)Mule的表達(dá)。
　　 方法：首先,用免疫印跡法檢測Mul

4、e,Mizl,JNK,p38,和c-Jun在野生型(WT),Jnk1-/-and Jnk2-/-細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。我們把JNK1重新引進(jìn)Jnk1-/-細(xì)胞,在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)JNK1,或用siRNA降低JNK1的表達(dá),用免疫印跡法分別檢測Mule的表達(dá)水平。采用半定量RT-PCR檢測Mule在WT,Jnk1-/-andJnk2-/-細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平。我們用USCS得到了預(yù)測的Mule啟動(dòng)子序列,把它亞克隆到?jīng)]有啟動(dòng)子

5、的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL2-Basic中,命名為MP-LUC。在共轉(zhuǎn)錄RSV-c-Jun或者空載體,以及TNFα分別誘導(dǎo)WT,Jnk1-/-and Jnk2-/-的情況下,用熒光素酶活性分析法檢測Mule啟動(dòng)子的活性。最后,我們用TFSEARCH程序(1.3版本)鑒別得到了Mule啟動(dòng)子上的AP-1結(jié)合位點(diǎn)。在不受TNFα刺激和在TNFα刺激的情況下,采用染色質(zhì)免疫沉淀分析法(ChIP)分別檢測體內(nèi)c-Jun蛋白和Mule啟動(dòng)子上A

6、P-1位點(diǎn)的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：免疫印跡法分析顯示Mule的蛋白水平在。Jnk1-/-細(xì)胞中大大減少,其c-Jun蛋白的表達(dá)量也少于Jnk2-/-和WT細(xì)胞。把JNK1重新引進(jìn)Jnk1-/-細(xì)胞,Mule的蛋白表達(dá)得到了部分修復(fù)。通過轉(zhuǎn)染HA-JNK1質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)JNK1,進(jìn)一步增加了Mule蛋白的表達(dá)。通過siRNA基因沉沒降低JNK1的表達(dá),大大減少了Mule的表達(dá)水平。半定量RT-PCR檢測顯示,Mu

7、le的mRNA在WT,Jnk1-/-和Jnk2-/-細(xì)胞中的表達(dá)情況和其蛋白的表達(dá)情況一致。共轉(zhuǎn)染RSV-c-Jun促進(jìn)了Mule啟動(dòng)子的活性,而且其活性的增強(qiáng)趨勢與c-Jun表達(dá)的增強(qiáng)趨勢相一致。TNFα刺激下,Jnk2-/-細(xì)胞中MP-LUC的活性大大增強(qiáng),其程度高于在WT細(xì)胞中。而MP-LUC的報(bào)告基因表達(dá)情況在TNFα后沒有明顯的改變。染色質(zhì)免疫沉淀分析法顯示,在未受刺激的情況下,WT細(xì)胞中c-Jun已經(jīng)結(jié)合在Mule啟動(dòng)子上的