糜蛋白酶途徑在敘利亞金黃地鼠胰島局部腎素血管緊張素系統(tǒng)的效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病是21世紀(jì)人類所面臨的主要疾病之一,是導(dǎo)致人群健康狀態(tài)下降和諸多血管疾病的主要因為。糖尿病及其并發(fā)癥不但使患者生活質(zhì)量降低,同時也給整個社會帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。既往研究表明,胰島β細(xì)胞功能障礙則是2型糖尿病發(fā)生之核心所在。循環(huán)和局部的RAS活化可能是胰島β細(xì)胞功能損害的重要因素,可能籍此介導(dǎo)2型糖尿病發(fā)生發(fā)展。循證學(xué)研究指出阻斷RAS可以減少危險人群糖尿病的發(fā)生率,改善糖尿病患者的糖代謝紊亂,有可能成為

2、2型糖尿病防治研究的新靶點。基于上述觀點和結(jié)論,本課題組選擇敘利亞金黃地鼠離體胰島作為研究模型,深入研究Ang Ⅱ的生成途徑及病理條件下胰島局部RAS中AngⅡ的生成的變化,探索從糜蛋白酶途徑在局部RAS中對AngⅡ的生成貢獻以及阻斷該途徑可能帶來的胰島保護效應(yīng)。希望在此基礎(chǔ)上進一步揭示2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的病理生理機制,為2型糖尿病的發(fā)病和相關(guān)并發(fā)癥機制提供新的理論學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.通過對麻醉

3、后敘利亞金黃地鼠胰腺的原位膽管內(nèi)插管、膠原酶Ⅴ灌注、水浴消化以及Ficoll密度梯度法純化、DTZ染色等方法獲取高存活率的敘利亞金黃地鼠的胰島細(xì)胞并對其進行功能鑒定。通過對高果糖聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建敘利亞金黃地鼠糖脂代謝異常的模型。
　　 2.探討糜蛋白酶抑素、卡托普利、α-抗胰蛋白酶、抑肽酶等不同抑制劑阻斷局部腎素血管緊張素系統(tǒng)后敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞生成AngⅡ的變化。進一步分析敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞局部RAS系統(tǒng)中Ang

4、Ⅱ生成的途徑并初步探討其形成的機制。探查血脂譜異常血癥敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞生成Ang Ⅱ的變化。對比分析正常與病理狀態(tài)下敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞局部RAS系統(tǒng)中AngⅡ生成的變化并探討相關(guān)機制。
　　 研究方法
　　 1.選取雄性敘利亞金黃地鼠,禁食24h后腹腔注射水合氯醛(3ml/kg)麻醉。開腹后順十二指腸找到主胰管,近腸端結(jié)扎膽總管及其分支。逆行穿刺膽管內(nèi)插管。注入膠原酶Ⅴ使胰腺充分膨脹。摘取胰腺立即置于消化瓶中3

5、7℃水浴消化。待消化完成后加入含血清培養(yǎng)液終止消化。收集沉淀液后以不連續(xù)密度梯度法純化胰島。將配好的DTZ溶液加入到純化后的沉淀之中,室溫避光染色后置于倒置顯微鏡下觀察并結(jié)合圖像分析軟件計數(shù)。利用臺盼蘭染色法測定胰島細(xì)胞活率。
　　 2.隨機選取健康雄性地鼠,以高脂高果糖飼料喂養(yǎng)。實驗開始前測量各組動物體重,并通過眼內(nèi)眥靜脈采血測血清膽固醇,甘油三酯,血肌酐,血糖。喂養(yǎng)后4周再次測量上述指標(biāo)并記錄。
　　 3.倒置顯微鏡

6、下挑選經(jīng)分離純化后的敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞加于24孔板中,加入含小牛血清的培養(yǎng)基預(yù)孵育30min。按標(biāo)記分為①對照組、②卡托普利組、③糜蛋白酶抑素組、④抑肽酶組、⑤α-抗胰蛋白酶組以及⑥卡托普利+糜蛋白酶抑素組共6個組,各組均添加血管緊張素Ⅰ(0.02 μ mol/l)后再按組別依次加入PBS、卡托普利(終濃度1mmol/L)、糜蛋白酶抑素(終濃度1mmol/L)、抑肽酶(終濃度1mmol/L)、α-抗胰蛋白酶(終濃度50 μ g/ml

7、)、卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素(終濃度均為1mmol/L)干預(yù)胰島細(xì)胞。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120min后收集各孔液體,離心后取上清,采用競爭法ELISA檢測上清中Ang Ⅱ濃度。同時測定卡托普利、糜蛋白酶抑素、抑肽酶、α-抗胰蛋白酶及PBS原液中AngⅡ濃度排除試劑假陽性所致干擾。分離純化血脂譜異常血癥雄性敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞,按照上述所提及相關(guān)方法加入各種抑制劑,之后同樣以競爭法ELISA檢測上清中AngⅡ濃度。
　　 研究結(jié)果

8、
　　 1.敘利亞金黃地鼠胰腺消化后經(jīng)DTZ染色觀察鏡下胰島細(xì)胞呈紅色或猩紅色。胰島細(xì)胞形態(tài)完整,胰島包膜清晰可見,折光性好,無破損,純化后胰島細(xì)胞基本不含外分泌腺組織。純化后每只地鼠胰腺可獲得胰島細(xì)胞近400個胰島細(xì)胞當(dāng)量(IEQ),胰島純度>90％,胰島活率>9096。分離純化后的胰島經(jīng)體外培養(yǎng)1周后生長狀況良好。
　　 2.含高脂飼料喂養(yǎng)組與普食喂養(yǎng)組的敘利亞金黃地鼠血清甘油三酯,膽固醇差異明顯,但血葡萄糖,肌酐及

9、體重水平差異不具統(tǒng)計學(xué)意義。喂養(yǎng)前后,各組動物體重,膽固醇,甘油三酯,血糖,肌酐水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.通過比較本實驗所加入的卡托普利、糜蛋白酶抑素、抑肽酶、α-抗胰蛋白酶及PBS原液的陰性對照結(jié)果發(fā)現(xiàn):除對照組中Ang Ⅱ濃度為82.49pg/ml,其余各組試劑原液Ang Ⅱ濃度均小于2.00pg/ml,所添加的各種試劑和抑制劑原液中基本不含Ang Ⅱ(P<0.01)。
　　 4.通過競爭ELISA法對干

10、預(yù)后胰島細(xì)胞局部Ang Ⅱ的檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組以及卡托普利+糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ較對照組減少。其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的Ang Ⅱ分別較對照組減少了42.50％和50.94％(P<0.01),但兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果雖不及前兩組,但分別較對照組減少了20.04％和18.67％(P<0.05)?？ㄍ衅绽?糜蛋白酶抑素組較對照組Ang

11、Ⅱ的生成銳減81.82％(P<0.01)。
　　 5.通過對病理狀態(tài)下即血脂譜異常血癥狀態(tài)下胰島細(xì)胞局部Ang Ⅱ的檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):各干預(yù)組AngⅡ均較對照組減少。其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的Ang Ⅱ分別較對照組減少了39.49％和56.7005,與之前不同的是,卡托普利組和糜蛋白酶抑素組在此項研究中對Ang Ⅱ抑制呈現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果仍然不如上述兩組明顯,分別較對照組減少了22.02

12、％和24.88％,卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素組較對照組Ang Ⅱ的生成減少了78.34％。
　　 研究結(jié)論
　　 1.原位膽管內(nèi)插管聯(lián)合膠原酶灌注消化可獲取高純度、高活率的敘利亞金黃地鼠胰島細(xì)胞。
　　 2.經(jīng)短期高脂飼料喂養(yǎng)已經(jīng)可以構(gòu)建敘利亞金黃地鼠血脂譜異常血癥的動物模型。
　　 3.敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成除經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑之外還存在有糜蛋白酶途徑。正常敘利亞金黃地鼠中由血管