內(nèi)毒素血癥幼年大鼠小腸粘膜損傷時(shí)JNK-c-Jun及PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及谷氨酰胺保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、嚴(yán)重感染是兒科危重癥中胃腸功能障礙的常見病因之一，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)毒素血癥和腸屏障功能破壞密切相關(guān)。內(nèi)毒素系革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁成份，其主要生物活性成份為脂多糖(lipopolysacchcride，LPS)。胃腸功能障礙在危重癥中的重要性越來越受到重視，被認(rèn)為是多臟器功能障礙的始發(fā)因素之一。小兒胃腸功能障礙和衰竭，常提示病情加重和預(yù)后不良。機(jī)體在受到革蘭氏陰性細(xì)菌的感染時(shí)，LPS作用于細(xì)胞膜受體，通過細(xì)胞內(nèi)信號傳遞級聯(lián)使基因表達(dá)發(fā)生變化

2、，導(dǎo)致宿主細(xì)胞因子失控性表達(dá)，細(xì)胞發(fā)生代謝、形態(tài)等的變化，介導(dǎo)細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展。因此LPS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已成為一個(gè)廣泛注意的研究領(lǐng)域，近年來已取得了不少進(jìn)展。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，目前已確定出四條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal regu

3、lated proteinkinase.ERK)通路、C-Jun氨基未端激酶(C-Jun amino terminal kinase，JNK)通路、P38通路和ERK5通路。JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一條重要通路，c-jun是JNK下游的直接作用底物。除了被生長因子激活外，JNK通路還能被LPS、TNF-α、L-1、紫外線、射線、熱休克、細(xì)胞外高滲及DNA變性劑等激活。JNK 通路的激活與多種系統(tǒng)的促凋亡作用有關(guān)。有研究

4、報(bào)道，枯否細(xì)胞中JNK是LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要信號分子；JNK的激活可能參與了腦缺血所致神經(jīng)元的損傷及腦低氧預(yù)適應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展；在IL-10基因缺失鼠小腸缺血再灌注損傷模型中，也發(fā)現(xiàn)了JNK/C-Jun信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活。但有關(guān)嚴(yán)重感染致胃腸粘膜損傷時(shí)JNK/c-Jun通路的變化國內(nèi)外研究報(bào)道還很少。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-Kinase，P13K)是生長因子超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要分子， Akt是

5、原癌基因c-akt的表達(dá)編碼的絲/蘇氨基酸激酶，是P13K直接的靶蛋白。P13K主要通過生長因子與受體結(jié)合而激活，具有抗凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用，與多種生物學(xué)事件有關(guān)，如囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞存活、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡等。P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞的主要存活通路，對腸上皮細(xì)胞的存活、增殖和重建十分重要。有研究表明，P13K是激活NF-KB的上游途徑，而NF-K B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是LPS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的下游通路，活化

6、的NF-KB可誘導(dǎo)眾多炎癥相關(guān)的特異基因如TNF，L-6，L-8等的表達(dá)。但有關(guān)LPS與P13K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究很少，國內(nèi)尚未見報(bào)道。 谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是血液循環(huán)和組織內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸。腸粘膜和其它迅速增生的細(xì)胞的主要能量來源是Gln而非葡萄糖。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，Gln可以從維持腸粘膜屏障、對腸免疫功能的調(diào)節(jié)以及對腸道氧化損傷的保護(hù)作用等三個(gè)方面起到對腸屏障功能的保

7、護(hù)作用。適當(dāng)劑量Gln的腸外營養(yǎng)和腸內(nèi)營養(yǎng)，可以增加腸絨毛高度及粘膜表面積和隱窩深度，增加隱窩細(xì)胞的有絲分裂，加快腸上皮細(xì)胞的更新速度，增強(qiáng)修復(fù)能力，并能促進(jìn)腸道粘液素的合成，增強(qiáng)腸粘膜細(xì)胞間的緊密連接，減少上皮細(xì)胞的凋亡，阻止腸粘膜萎縮及炎癥所致的通透性增加。目前，對Gln能改善各種病理狀態(tài)的腸粘膜生長修復(fù)作用已給予充分的肯定，尤其在燒(創(chuàng))傷、感染、手術(shù)后、放化療腫瘤病人己取得一定效果。但其作用機(jī)制尚不完全清楚。 總之，LP

8、S通過作用于細(xì)胞膜受體，激活多條細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，形成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克，全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭等疾病的發(fā)生。尤其在小兒，因其自身的免疫功能以及腸道的屏障功能不全，嚴(yán)重感染所致的胃腸功能障礙，常是誘發(fā)其它器官功能障礙的原因，治療有一定的難度，一旦到晚期病死率極高，而小兒胃腸功能障礙的發(fā)病機(jī)理還不完全清楚，本研究對內(nèi)毒素血癥及谷氨酰胺治療后小腸粘膜JNK/c-Jun及P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

9、進(jìn)行研究，旨在探討LPS引起小腸粘膜損傷及谷氨酰胺對其保護(hù)作用的有關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以探索有效的預(yù)防和治療途徑。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 1、材料： 用腹腔注射內(nèi)毒素(4mg/kg大腸桿菌脂多O55:B5)方法制備18日齡大白鼠內(nèi)毒素血癥模型。不加任何處理因素為正常對照組，該組8只鼠。腹腔注射生理鹽水為假注射對照組，腹腔注射內(nèi)毒素為內(nèi)毒素組，腹腔注射內(nèi)毒素同時(shí)腹腔注射谷氨酰胺(2g/kg)為谷氨酰胺治療組，每組40只

10、鼠，分別于實(shí)驗(yàn)開始后2、4、6、24及72h各取8只鼠末段回腸4cm，分別放入10％中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片；2.5％戊二醛中保存，行電鏡檢測；液氮中速凍，儲存于-76冰箱，行蛋白及核酸檢測。 2、方法: 光鏡和透射電鏡下觀察小腸粘膜病理改變，免疫組化法檢測小腸粘膜增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)，原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測小腸上皮細(xì)胞的凋亡，RT-PCR法檢測JNK、c-Jun、P13K及AKTmRNA的表達(dá)

11、，Western Blot印跡分析檢測P13K總蛋白和JNK、c-Jull及AKT磷酸化蛋白的表達(dá)。采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、小腸形態(tài)學(xué)改變光鏡下小腸無明顯病理改變，電鏡下內(nèi)毒素組出現(xiàn)不同程度各種凋亡形態(tài)學(xué)改變，谷氨酰胺組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)病變程度有所減輕。 2、小腸上皮細(xì)胞的增殖及凋亡對照組小腸上皮PCNA陽性細(xì)胞很多，內(nèi)毒素組PCNA表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對照組(P<0.01)，2h表達(dá)

12、強(qiáng)度即明顯降低，4h-6h達(dá)到最低值，72h仍未恢復(fù)正常水平。谷氨酰胺組PCNA表達(dá)明顯高于內(nèi)毒素組(P<0.01)，但低于對照組(P<0.01)。與內(nèi)毒素組比較，2h、4h和24h時(shí)間點(diǎn)升高顯著。 對照組凋亡細(xì)胞很少，內(nèi)毒素組凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)，2h凋亡指數(shù)即明顯升高，24h達(dá)到高峰，72h仍未恢復(fù)正常。谷氨酰胺組凋亡指數(shù)雖較對照組高(P<0.01)，但各時(shí)間點(diǎn)均較內(nèi)毒素組下降(P=0.01)。谷氨酰胺組凋

13、亡指數(shù)隨時(shí)間而增加，72h尚未出現(xiàn)回落趨勢。 3、小腸JNK、c-Jun mRNA和蛋白表達(dá)分析內(nèi)毒素組JNK mRNA表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，2h開始明顯升高，6h達(dá)到高峰，72h尚未恢復(fù)正常。C-JuN mRNA的表達(dá)趨勢與JNK mRNA的表達(dá)相同。谷氨酰胺組JNK及c-Jun mRNA表達(dá)較內(nèi)毒素組有下降趨勢，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 內(nèi)毒素組p-JNK蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.01)，2h即開始

14、升高，4-6達(dá)到高峰，72h尚未恢復(fù)正常。谷氨酰胺組p-JNK表達(dá)雖較對照組高(P<0.01)，但較內(nèi)毒素組明顯下降(P=0.01)，其中4h和6h處下降顯著，高峰位于6h處。P-c-J吼蛋白表達(dá)趨勢與p-JNK表達(dá)相似，不同的是谷氨酰胺組p-c-Jun蛋白高峰位于4h處。 4、小腸P13K、Akt mRNA和蛋白表達(dá)分析內(nèi)毒素組P13K mRNA較對照組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P=0.05)，4h開始明顯升高，6h達(dá)到高峰，其它時(shí)間點(diǎn)表

15、達(dá)無明顯差異。谷氨酰胺組表達(dá)明顯高于內(nèi)毒素組(P<0.05)。內(nèi)毒素組.Akt mRNA較對照組表達(dá)無明顯升高，谷氨酰胺組與內(nèi)毒素組比較亦無明顯升高。 P13K總蛋白表達(dá)與P13K mRNA表達(dá)相似。P-Akt蛋白表達(dá)趨勢與P13K蛋白及Akt mRNA表達(dá)有所不同，內(nèi)毒素組p-Akt蛋白較對照組表達(dá)明顯增高(P<0.01)，4h開始明顯升高，24h才達(dá)高峰，72h表達(dá)水平與對照組已無顯著差別。谷氨酰胺組p-AKT蛋白表達(dá)明顯高

16、于內(nèi)毒素組(P<0.01)，2h開始顯著升高，4h達(dá)最高峰，6h后與內(nèi)毒素組幾乎相同。 結(jié)論: 1、內(nèi)毒素血癥幼鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡增加，增殖下降，細(xì)胞凋亡與增殖之間平衡的破壞是內(nèi)毒素血癥時(shí)腸屏障破壞的病理機(jī)制之一。 2、內(nèi)毒素血癥早期，幼鼠小腸JNK/c-Jun信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，導(dǎo)致小腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡增加，損傷加重；晚期P13K/Akt信號通路被激活，參與小腸上皮細(xì)胞的存活和增殖。 3、谷氨酰胺通過抑