基于PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討麝香通心滴丸抗心肌缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制.pdf

1、目的：心肌缺血發(fā)病率逐年增高，目前主要干預(yù)措施是手術(shù)和藥物治療。麝香通心滴丸治療冠心病療效確切，但其對心肌保護(hù)作用的機(jī)制仍有盲點(diǎn)。本課題從多角度探討麝香通心滴丸對心肌缺血PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響以及其有效成分的分析，以闡明麝香通心滴丸治療心肌缺血的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：⑴采用腹腔注射垂體后葉素建立SD大鼠急性心肌缺血動物模型。隨機(jī)分為空白組（0.9％生理鹽水灌胃），模型組（0.9％生理鹽水灌胃），對照組（單硝酸

2、異山梨酯4.0mg/kg·d藥液灌胃），麝香通心滴丸高劑量組（42 mg/kg·d藥液灌胃），麝香通心滴丸中劑量組（21 mg/kg·d藥液灌胃），連續(xù)給藥1周后，腹腔注射垂體后葉素，造模后檢測大鼠心電圖ST段的變化，分別取大鼠心肌和腹主動脈血液，ELISA檢測血液中LDH和CK-MB濃度的變化，光鏡觀察HE染色心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化，TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，qRT-PCR和免疫組化檢測心肌組織PI3K/Akt通路活化及其下游凋

3、亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。⑵采用Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立體外心肌缺血缺氧細(xì)胞模型。MTT檢測心肌細(xì)胞的活力情況，用梯度濃度法優(yōu)化Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡以及麝香通心滴丸干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡模型的量效關(guān)系和時效關(guān)系。隨機(jī)分為空白組、Na2S2O4模型組、麝香通心滴丸高劑量組（50μg/ml）、麝香通心滴丸低劑量組(25μg/ml)。麝香通心滴丸組預(yù)給藥后，除空白組外，分別加入Na2S2O4干預(yù)，再正常培養(yǎng)復(fù)氧后，MTT檢測心肌細(xì)胞活力

4、，Hoechst染色和流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞的凋亡情況，qRT-PCR及Western blot觀察心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路活化及其下游凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。⑶過LC-Q-TOF-MS和GC-MS聯(lián)用技術(shù)，摸索最佳色譜和質(zhì)譜條件，對麝香通心滴丸的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定;MTT和梯度濃度法優(yōu)化主要化學(xué)成分干預(yù)Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血缺氧模型的有效濃度;采用高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀檢測麝香通心滴丸有效成分對Hoechst33258染色心肌

5、細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：①麝香通心滴丸對垂體后葉素造模建立的大鼠心肌缺血模型的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明麝香通心滴丸能顯著性抑制ST段的抬高(P＜0.05)，顯著降低血液中LDH和CK-MB的含量(P＜0.05)，明顯改善心肌組織損傷，降低心肌細(xì)胞凋亡數(shù)(P＜0.05)。并且麝香通心滴丸下調(diào)了Bax的表達(dá)，上調(diào)了PI3K、p-Akt和Bcl-2的表達(dá)，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。②麝香通心滴丸對Na2S2O4誘導(dǎo)建立的

6、H9c2心肌細(xì)胞缺血缺氧模型的影響。用50μg/ml和25μg/ml濃度的麝香通心滴丸預(yù)給藥12h，作為有效作用濃度和時間，加入1mmol/ml Na2S2O4干預(yù)4h，復(fù)氧6h，作為誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的有效作用濃度和時間。各組干預(yù)后，麝香通心滴丸各濃度組的心肌細(xì)胞形態(tài)改善，明顯好于Na2S2O4模型組，凋亡細(xì)胞減少，細(xì)胞的存活率顯著性高于Na2S2O4模型組(P＜0.05);減少了心肌細(xì)胞的凋亡率，不同程度地下調(diào)了Bax的表達(dá)，上調(diào)了P

7、I3K、p-Akt和Bcl-2的表達(dá)，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。③麝香通心滴丸抗心肌缺血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究。建立最佳色譜和質(zhì)譜條件，分析并鑒定麝香通心滴丸揮發(fā)性化學(xué)成分17個，主要是麝香酮、龍腦和異龍腦等;非揮發(fā)性成分41個，主要為膽酸類、人參皂苷類、丹酚酸類和蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物等。對主要化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明，有效成分麝香酮、龍腦、異龍腦、膽酸、人參皂苷Rg1和Rg3等能不同程度地增強(qiáng)缺血缺氧心肌